The understanding of how proteins evolve to perform novel functions has long been sought by biologists. In this regard, two homologous bacterial enzymes, PafA and Dop, pose an insightful case study, as both rely on similar mechanistic properties, yet catalyze different reactions. PafA conjugates a small protein tag to target proteins, whereas Dop removes the tag by hydrolysis. Given that both enzymes present a similar fold and high sequence similarity, we sought to identify the differences in the amino acid sequence and folding responsible for each distinct activity. We tackled this question using analysis of sequence-function relationships, and identified a set of uniquely conserved residues in each enzyme. Reciprocal mutagenesis of the hydrolase, Dop, completely abolished the native activity, at the same time yielding a catalytically active ligase. Based on the available Dop and PafA crystal structures, this change of activity required a conformational change of a critical loop at the vicinity of the active site. We identified the conserved positions essential for stabilization of the alternative loop conformation, and tracked alternative mutational pathways that lead to a change in activity. Remarkably, all these pathways were combined in the evolution of PafA and Dop, despite their redundant effect on activity. Overall, we identified the residues and structural elements in PafA and Dop responsible for their activity differences. This analysis delineated, in molecular terms, the changes required for the emergence of a new catalytic function from a preexisting one.

中文翻译：

---

探索蛋白质空间：从水解酶到取代酶（通过取代）。

生物学家长期以来一直寻求对蛋白质如何进化以执行新功能的理解。在这方面，两种同源的细菌酶，PafA和Dop，构成了有深刻见解的案例研究，因为它们都依赖于相似的机械特性，但催化不同的反应。PafA将一个小的蛋白质标签结合到目标蛋白质上，而Dop通过水解去除标签。鉴于两种酶都呈现相似的折叠和高度的序列相似性，我们试图确定氨基酸序列和折叠中每个不同活性的原因。我们通过分析序列-功能关系解决了这个问题，并在每种酶中鉴定出一组独特的保守残基。水解酶Dop的相互诱变完全消除了天然活性，同时产生催化活性的连接酶。根据可用的Dop和PafA晶体结构，这种活性变化需要在活性位点附近的关键环发生构象变化。我们确定了保守的位置，对稳定备用环构象至关重要，并跟踪了导致活性改变的替代突变途径。值得注意的是，所有这些途径在PafA和Dop的进化中都被结合在一起，尽管它们对活性有多余的影响。总体而言，我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。这种活性变化需要在活性位点附近的关键环的构象变化。我们确定了保守的位置，对稳定备用环构象至关重要，并跟踪了导致活性改变的替代突变途径。值得注意的是，所有这些途径在PafA和Dop的进化中都被结合在一起，尽管它们对活性有多余的影响。总体而言，我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。这种活性变化需要在活性位点附近的关键环的构象变化。我们确定了保守的位置，对于稳定替代环构象至关重要，并跟踪了导致活性改变的替代突变途径。值得注意的是，所有这些途径在PafA和Dop的进化中都被结合在一起，尽管它们对活性有多余的影响。总体而言，我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。我们确定了保守的位置，对稳定备用环构象至关重要，并跟踪了导致活性改变的替代突变途径。值得注意的是，所有这些途径在PafA和Dop的进化中都被结合在一起，尽管它们对活性有多余的影响。总体而言，我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。我们确定了保守的位置，对于稳定替代环构象至关重要，并跟踪了导致活性改变的替代突变途径。值得注意的是，所有这些途径在PafA和Dop的进化中都被结合在一起，尽管它们对活性有多余的影响。总体而言，我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。我们确定了PafA和Dop中的残基和结构元件，这是造成它们活性差异的原因。这项分析从分子角度描述了从先前存在的新催化功能的出现所需的变化。