Cryopreservation of larvae of Greenshell™ mussel Perna canaliculus, the most cultivated species in New Zealand, can provide flexibility for selective breeding programmes and enhance its global production. In this study, we set out to develop a reliable protocol for freezing D-stage larvae of Greenshell™ mussels that ensured long-term survival for successful rearing of thawed larvae in the hatchery. The effects of different combinations of cryoprotecting agents (CPA), varying CPA equilibration times, larval concentrations per straw as well as different larval development stages (48 h vs 72 h old) were evaluated by assessing the behavioural response (swimming activity, algal consumption), shell size and survival of larvae, up to 4 days post-thawing. The protocol yielding the best larval performances was a combination of the following CPA (final concentrations): 14% ethylene-glycol (EG) + 0.6 M trehalose (TRE) + 1% polyvinyl-pyrrolidone (PVP), prepared with Milli-Q water. Stocking densities ranging from 50,000 to 150,000 larvae per straw (0.25 mL) and a 20 min equilibration time gave the best results, while no significant differences in fitness were found between larvae cryopreserved at 48 h nor 72 h-old. Using the improved cryopreservation protocol, over 50% of previously cryopreserved D-larvae were able to survive after 4 days of rearing, compared with 65% in the unfrozen control. More importantly, about one third of thawed larvae were able to swim and feed, and to potentially develop further. These findings contribute to enhance the selective breeding programmes for this species.

中文翻译：

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开发冷冻保存绿壳贻贝™ (Perna canaliculus) veliger 幼虫的方法

Greenshell™ 贻贝 Perna canaliculus 幼虫的冷冻保存是新西兰栽培最多的物种，可以为选择性育种计划提供灵活性并提高其全球产量。在这项研究中，我们着手开发一种用于冷冻 Greenshell™ 贻贝 D 期幼体的可靠方案，以确保在孵化场成功饲养解冻幼体的长期存活。通过评估行为反应（游泳活动、藻类消耗）来评估冷冻保护剂 (CPA) 的不同组合、不同的 CPA 平衡时间、每根稻草的幼虫浓度以及不同的幼虫发育阶段（48 小时与 72 小时）的影响, 壳大小和幼虫的存活率，解冻后最多 4 天。产生最佳幼虫性能的方案是以下 CPA（最终浓度）的组合：14% 乙二醇 (EG) + 0.6 M 海藻糖 (TRE) + 1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，用 Milli-Q 水制备. 每根吸管 (0.25 mL) 50,000 至 150,000 只幼虫的放养密度和 20 分钟的平衡时间给出了最佳结果，而在 48 小时和 72 小时冷冻保存的幼虫之间没有发现适合度的显着差异。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。14% 乙二醇 (EG) + 0.6 M 海藻糖 (TRE) + 1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，用 Milli-Q 水制备。每根吸管 (0.25 mL) 50,000 至 150,000 只幼虫的放养密度和 20 分钟的平衡时间给出了最佳结果，而在 48 小时和 72 小时冷冻保存的幼虫之间没有发现适合度的显着差异。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。14% 乙二醇 (EG) + 0.6 M 海藻糖 (TRE) + 1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，用 Milli-Q 水制备。每根吸管 (0.25 mL) 50,000 至 150,000 只幼虫的放养密度和 20 分钟的平衡时间给出了最佳结果，而在 48 小时和 72 小时冷冻保存的幼虫之间没有发现适合度的显着差异。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。每根吸管 (0.25 mL) 50,000 至 150,000 只幼虫的放养密度和 20 分钟的平衡时间给出了最佳结果，而在 48 小时和 72 小时冷冻保存的幼虫之间没有发现适合度的显着差异。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。每根吸管 (0.25 mL) 50,000 至 150,000 只幼虫的放养密度和 20 分钟的平衡时间给出了最佳结果，而在 48 小时和 72 小时冷冻保存的幼虫之间没有发现适合度的显着差异。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。使用改进的冷冻保存方案，超过 50% 的先前冷冻保存的 D 幼虫在饲养 4 天后能够存活，而未冷冻对照中的这一比例为 65%。更重要的是，大约三分之一的解冻幼虫能够游泳和进食，并有可能进一步发育。这些发现有助于加强该物种的选择性育种计划。