In vitro, Drosophila melanogaster Dicer-2 (Dcr-2) uses its helicase domain to initiate processing of dsRNA with blunt (BLT) termini, and its Platform•PAZ domain to initiate processing of dsRNA with 3' overhangs (ovrs). To understand the relationship of these in vitro observations to roles of Dcr-2 in vivo, we compared in vitro effects of two helicase mutations to their impact on production of endogenous and viral siRNAs in flies. Consistent with the importance of the helicase domain in processing BLT dsRNA, both point mutations eliminated processing of BLT, but not 3'ovr, dsRNA in vitro. However, the mutations had different effects in vivo. A point mutation in the Walker A motif of the Hel1 subdomain, G31R, largely eliminated production of siRNAs in vivo, while F225G, located in the Hel2 subdomain, showed reduced levels of endogenous siRNAs, but did not significantly affect virus-derived siRNAs. In vitro assays monitoring dsRNA cleavage, dsRNA binding, ATP hydrolysis, and binding of the accessory factor Loquacious-PD, provided insight into the different effects of the mutations on processing of different sources of dsRNA in flies. Our in vitro studies suggest effects of the mutations in vivo relate to their effects on ATPase activity, dsRNA binding, and interactions with Loquacious-PD. Our studies emphasize the importance of future studies to characterize dsRNA termini as they exist in drosophila and other animals.

中文翻译：

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体外研究深入了解黑腹果蝇中 Dicer-2 解旋酶突变的影响

在体外，Drosophila melanogaster Dicer-2 (Dcr-2) 使用其解旋酶域来启动带有钝端 (BLT) 末端的 dsRNA 加工，并使用其 Platform•PAZ 域来启动带有 3' 突出端 (ovrs) 的 dsRNA 加工。为了了解这些体外观察结果与体内 Dcr-2 作用的关系，我们比较了两种解旋酶突变的体外效应及其对果蝇内源性和病毒性 siRNA 产生的影响。与解旋酶结构域在加工 BLT dsRNA 中的重要性一致，两种点突变都消除了 BLT 的加工，但不消除 3'ovr 体外 dsRNA。然而，这些突变在体内具有不同的影响。Hel1 子域 G31R 的 Walker A 基序中的点突变在很大程度上消除了体内 siRNA 的产生，而位于 Hel2 子域中的 F225G，显示内源性 siRNA 水平降低，但没有显着影响病毒衍生的 siRNA。监测 dsRNA 切割、dsRNA 结合、ATP 水解和辅助因子 Loquacious-PD 结合的体外测定，提供了对突变对果蝇不同来源 dsRNA 加工的不同影响的洞察。我们的体外研究表明，体内突变的影响与它们对 ATPase 活性、dsRNA 结合以及与 Loquacious-PD 相互作用的影响有关。我们的研究强调了未来研究表征 dsRNA 末端的重要性，因为它们存在于果蝇和其他动物中。提供了对突变对果蝇不同来源 dsRNA 加工的不同影响的见解。我们的体外研究表明，体内突变的影响与它们对 ATPase 活性、dsRNA 结合以及与 Loquacious-PD 相互作用的影响有关。我们的研究强调了未来研究表征 dsRNA 末端的重要性，因为它们存在于果蝇和其他动物中。提供了对突变对果蝇不同来源 dsRNA 加工的不同影响的见解。我们的体外研究表明，体内突变的影响与它们对 ATPase 活性、dsRNA 结合以及与 Loquacious-PD 相互作用的影响有关。我们的研究强调了未来研究表征 dsRNA 末端的重要性，因为它们存在于果蝇和其他动物中。