Bacteria are versatile living systems that enhance our understanding of nature and enable biosynthesis of valuable chemicals. Long fragment editing techniques are of great importance for accelerating bacterial genome engineering to obtain desirable and genetically stable strains. However, the existing genome editing methods cannot meet the needs of engineers. We herein report an efficient long fragment editing method for large-scale and scarless genome engineering in Escherichia coli. The method enabled us to insert DNA fragments up to 12 kb into the genome and to delete DNA fragments up to 186.7 kb from the genome, with positive rates over 95%. We applied this method for E. coli genome simplification, resulting in 12 individual deletion mutants and four cumulative deletion mutants. The simplest genome lost a total of 370.6 kb of DNA sequence containing 364 open reading frames. Additionally, we applied this technique to metabolic engineering and obtained a genetically stable plasmid-independent isobutanol production strain that produced 1.3 g/L isobutanol via shake-flask fermentation. These results suggest that the method is a powerful genome engineering tool, highlighting its potential to be applied in synthetic biology and metabolic engineering. KEY POINTS: • This article reports an efficient genome engineering tool for E. coli. • The tool is advantageous for the manipulations of long DNA fragments. • The tool has been successfully applied for genome simplification. • The tool has been successfully applied for metabolic engineering.

中文翻译：

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高效的长片段编辑技术可实现大规模且无痕的细菌基因组工程。

细菌是多用途的生命系统，可增强我们对自然的理解并实现有价值化学物质的生物合成。长片段编辑技术对于加速细菌基因组工程以获得所需和遗传稳定的菌株非常重要。但是，现有的基因组编辑方法不能满足工程师的需求。我们在这里报告了一种有效的长片段编辑方法，用于大肠杆菌中的大规模和无痕基因组工程。该方法使我们能够将高达12 kb的DNA片段插入基因组，并从基因组中删除高达186.7 kb的DNA片段，阳性率超过95％。我们将这种方法用于大肠杆菌基因组简化，产生了12个个体缺失突变体和4个累积缺失突变体。最简单的基因组总共损失了370个。含有364个开放阅读框的6 kb DNA序列。此外，我们将此技术应用于代谢工程，并获得了基因稳定的不依赖质粒的异丁醇生产菌株，该菌株通过摇瓶发酵生产了1.3 g / L的异丁醇。这些结果表明该方法是一种功能强大的基因组工程工具，突出了其在合成生物学和代谢工程中应用的潜力。要点：•本文报告了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。•该工具对于长DNA片段的操作非常有利。•该工具已成功应用于基因组简化。•该工具已成功应用于代谢工程。我们将此技术应用于代谢工程，并获得了基因稳定的不依赖质粒的异丁醇生产菌株，该菌株通过摇瓶发酵生产了1.3 g / L的异丁醇。这些结果表明该方法是一种功能强大的基因组工程工具，突出了其在合成生物学和代谢工程中应用的潜力。要点：•本文报告了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。•该工具对于长DNA片段的操作非常有利。•该工具已成功应用于基因组简化。•该工具已成功应用于代谢工程。我们将此技术应用于代谢工程，并获得了基因稳定的不依赖质粒的异丁醇生产菌株，该菌株通过摇瓶发酵生产了1.3 g / L的异丁醇。这些结果表明该方法是一种功能强大的基因组工程工具，突出了其在合成生物学和代谢工程中应用的潜力。要点：•本文报告了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。•该工具对于长DNA片段的操作非常有利。•该工具已成功应用于基因组简化。•该工具已成功应用于代谢工程。强调了其在合成生物学和代谢工程中应用的潜力。要点：•本文报告了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。•该工具对于长DNA片段的操作非常有利。•该工具已成功应用于基因组简化。•该工具已成功应用于代谢工程。强调了其在合成生物学和代谢工程中应用的潜力。要点：•本文报告了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。•该工具对于长DNA片段的操作非常有利。•该工具已成功应用于基因组简化。•该工具已成功应用于代谢工程。