Modular polyketide synthases (PKSs) produce complex, bioactive secondary metabolites in assembly line-like multistep reactions. Longstanding efforts to produce novel, biologically active compounds by recombining intact modules to new modular PKSs have mostly resulted in poorly active chimeras and decreased product yields. Recent findings demonstrate that the low efficiencies of modular chimeric PKSs also result from rate limitations in the transfer of the growing polyketide chain across the noncognate module:module interface and further processing of the non-native polyketide substrate by the ketosynthase (KS) domain. In this study, we aim at disclosing and understanding the low efficiency of chimeric modular PKSs and at establishing guidelines for modular PKSs engineering. To do so, we work with a bimodular PKS testbed and systematically vary substrate specificity, substrate identity, and domain:domain interfaces of the KS involved reactions. We observe that KS domains employed in our chimeric bimodular PKSs are bottlenecks with regards to both substrate specificity as well as interaction with the acyl carrier protein (ACP). Overall, our systematic study can explain in quantitative terms why early oversimplified engineering strategies based on the plain shuffling of modules mostly failed and why more recent approaches show improved success rates. We moreover identify two mutations of the KS domain that significantly increased turnover rates in chimeric systems and interpret this finding in mechanistic detail.

中文翻译：

---

酮合酶结构域限制了聚酮化合物合酶的设计。

模块化聚酮化合物合酶（PKSs）在组装线状多步反应中产生复杂的，具有生物活性的次级代谢产物。通过将完整的模块重组为新的模块化PKS来生产新型的具有生物活性的化合物的长期努力，大多导致了嵌合体活性低下和产品收率下降。最近的发现表明，模块化嵌合PKSs的低效率也是由于速率增长受到限制的，该速率限制是增长的聚酮化合物链通过非同源模块：模块界面的转移以及酮合酶（KS）结构域对非天然聚酮化合物底物的进一步处理。在这项研究中，我们旨在揭示和理解嵌合模块化PKS的低效率，并建立模块化PKS工程的指导方针。为此，我们使用双模块PKS测试平台，系统地改变了KS涉及的反应的底物特异性，底物同一性和domain：domain接口。我们观察到，在我们的嵌合双模块PKS中使用的KS结构域是底物特异性以及与酰基载体蛋白（ACP）相互作用的瓶颈。总的来说，我们的系统研究可以定量地解释为什么早期基于模块的简单改组而过度简化的工程策略大多会失败，以及为什么最近的方法显示出更高的成功率。此外，我们确定了KS结构域的两个突变，这些突变显着提高了嵌合系统的周转率，并详细解释了这一发现。我们观察到，在我们的嵌合双模块PKS中使用的KS结构域是底物特异性以及与酰基载体蛋白（ACP）相互作用的瓶颈。总的来说，我们的系统研究可以定量地解释为什么早期基于模块的简单改组而过度简化的工程策略大多会失败，以及为什么最近的方法显示出更高的成功率。此外，我们确定了KS结构域的两个突变，这些突变显着提高了嵌合系统的周转率，并以机械细节解释了这一发现。我们观察到，在我们的嵌合双模块PKS中使用的KS结构域是底物特异性以及与酰基载体蛋白（ACP）相互作用的瓶颈。总的来说，我们的系统研究可以定量地解释为什么早期基于模块的简单改组而过度简化的工程策略大多会失败，以及为什么最近的方法显示出更高的成功率。此外，我们确定了KS结构域的两个突变，这些突变显着提高了嵌合系统的周转率，并以机械细节解释了这一发现。我们的系统研究可以定量地解释为什么早期基于模块的简单改组而过度简化的工程策略大多会失败，以及为什么最近的方法显示出更高的成功率。此外，我们确定了KS结构域的两个突变，这些突变显着提高了嵌合系统的周转率，并以机械细节解释了这一发现。我们的系统研究可以定量地解释为什么早期基于模块的简单改组而过度简化的工程策略大多会失败，以及为什么最近的方法显示出更高的成功率。此外，我们确定了KS结构域的两个突变，这些突变显着提高了嵌合系统的周转率，并以机械细节解释了这一发现。