The nuclear-localized CAX-interacting protein VvCXIP4 is exported to the cytosol after a Ca2+ pulse, to activate the tonoplast-localized Ca2+/H+ exchanger VvCAX3. Vacuolar cation/H+ exchangers (CAXs) have long been recognized as ‘housekeeping’ components in cellular Ca2+ and trace metal homeostasis, being involved in a range of key cellular and physiological processes. However, the mechanisms that drive functional activation of the transporters are largely unknown. In the present study, we investigated the function of a putative grapevine CAX-interacting protein, VvCXIP4, by testing its ability to activate VvCAX3, previously characterized as a tonoplast-localized Ca2+/H+ exchanger. VvCAX3 contains an autoinhibitory domain that drives inactivation of the transporter and thus, is incapable of suppressing the Ca2+-hypersensitive phenotype of the S. cerevisiae mutant K667. In this study, the co-expression of VvCXIP4 and VvCAX3 in this strain efficiently rescued its growth defect at high Ca2+ levels. Flow cytometry experiments showed that yeast harboring both proteins effectively accumulated higher Ca2+ levels than cells expressing each of the proteins separately. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays allowed visualization of the direct interaction between the proteins in tobacco plants and in yeast, and also showed the self-interaction of VvCAX3 but not of VvCXIP4. Subcellular localization studies showed that, despite being primarily localized to the nucleus, VvCXIP4 is able to move to other cell compartments upon a Ca2+ stimulus, becoming prone to interaction with the tonoplast-localized VvCAX3. qPCR analysis showed that both genes are more expressed in grapevine stems and leaves, followed by the roots, and that the steady-state transcript levels were higher in the pulp than in the skin of grape berries. Also, both VvCXIP4 and VvCAX3 were upregulated by Ca2+ and Na+, indicating they share common regulatory mechanisms. However, VvCXIP4 was also upregulated by Li+, Cu2+ and Mn2+, and its expression increased steadily throughout grape berry development, contrary to VvCAX3, suggesting additional physiological roles for VvCXIP4, including the regulation of VvCAXs not yet functionally characterized. The main novelty of the present study was the demonstration of physical interaction between CXIP and CAX proteins from a woody plant model by BiFC assays, demonstrating the intracellular mobilization of CXIPs in response to Ca2+.

中文翻译：

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葡萄藤 CAX 相互作用蛋白 VvCXIP4 从细胞核中输出以激活液泡膜 Ca2+/H+ 交换器 VvCAX3

在 Ca2+ 脉冲后，核定位的 CAX 相互作用蛋白 VvCXIP4 被输出到细胞质中，以激活液泡质定位的 Ca2+/H+ 交换器 VvCAX3。液泡阳离子/H+ 交换剂 (CAX) 长期以来被认为是细胞 Ca2+ 和微量金属稳态中的“管家”成分，参与了一系列关键的细胞和生理过程。然而，驱动转运蛋白功能激活的机制在很大程度上是未知的。在本研究中，我们通过测试其激活 VvCAX3 的能力来研究推定的葡萄树 CAX 相互作用蛋白 VvCXIP4 的功能，VvCAX3 以前被表征为液泡膜定位的 Ca2+/H+ 交换剂。VvCAX3 包含一个自抑制结构域，可驱动转运蛋白失活，因此无法抑制 S. 链球菌的 Ca2+ 超敏表型。酿酒酵母突变体 K667。在这项研究中，VvCXIP4 和 VvCAX3 在该菌株中的共表达有效地挽救了其在高 Ca2+ 水平下的生长缺陷。流式细胞术实验表明，与分别表达每种蛋白质的细胞相比，含有这两种蛋白质的酵母有效地积累了更高的 Ca2+ 水平。双分子荧光互补 (BiFC) 分析可以显示烟草植物和酵母中蛋白质之间的直接相互作用，并且还显示了 VvCAX3 的自我相互作用，但 VvCXIP4 没有。亚细胞定位研究表明，尽管 VvCXIP4 主要定位于细胞核，但在 Ca2+ 刺激下能够移动到其他细胞区室，变得容易与定位于液泡膜的 VvCAX3 相互作用。qPCR 分析表明，这两个基因在葡萄茎和叶中的表达更多，其次是根，并且在果肉中的稳态转录水平高于在葡萄浆果的表皮中。此外，VvCXIP4 和 VvCAX3 均被 Ca2+ 和 Na+ 上调，表明它们具有共同的调节机制。然而，VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳步增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有额外的生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。其次是根，果肉中的稳态转录水平高于葡萄浆果皮中的稳态转录水平。此外，VvCXIP4 和 VvCAX3 均被 Ca2+ 和 Na+ 上调，表明它们具有共同的调节机制。然而，VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳定增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有其他生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。其次是根，果肉中的稳态转录水平高于葡萄浆果皮中的稳态转录水平。此外，VvCXIP4 和 VvCAX3 均被 Ca2+ 和 Na+ 上调，表明它们具有共同的调节机制。然而，VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳定增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有其他生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。并且果肉中的稳态转录水平高于葡萄浆果皮中的稳态转录水平。此外，VvCXIP4 和 VvCAX3 均被 Ca2+ 和 Na+ 上调，表明它们具有共同的调节机制。然而，VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳步增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有额外的生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。并且果肉中的稳态转录水平高于葡萄浆果皮中的稳态转录水平。此外，VvCXIP4 和 VvCAX3 均被 Ca2+ 和 Na+ 上调，表明它们具有共同的调节机制。然而，VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳步增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有额外的生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳步增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有额外的生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。VvCXIP4 也被 Li+、Cu2+ 和 Mn2+ 上调，并且其表达在整个葡萄浆果发育过程中稳步增加，这与 VvCAX3 相反，这表明 VvCXIP4 具有额外的生理作用，包括尚未功能表征的 VvCAX 的调节。本研究的主要新颖之处是通过 BiFC 分析证明了 CXIP 和来自木本植物模型的 CAX 蛋白之间的物理相互作用，证明了 CXIP 响应于 Ca2+ 的细胞内动员。