RNA-guided and RNA-targeting type IV-D CRISPR/Cas systems (CRISPR/Cas13d) have recently been identified and employed for efficient and specific RNA knockdown in mammalian and plant cells. Cas13d possesses dual RNase activities and is capable of processing CRISPR arrays and cleaving target RNAs in a protospacer flanking sequence (PFS)-independent manner. These properties make this system a promising tool for multiplex gene expression regulation in microbes. Herein, we aimed to establish a CRISPR/Cas13d-mediated RNA knockdown platform for bacterial chassis. CasRx, Cas13d from Ruminococcus flavefaciens XPD3002, was selected due to its high activity. However, CasRx was found to be highly toxic to both Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum, especially when it cooperated with its guide and target RNAs. After employing a low copy number vector, a tightly controlled promoter, and a weakened ribosome binding site, we successfully constructed an inducible expression system for CasRx and applied it for repressing the expression of a green fluorescent protein (GFP) in E. coli. Despite our efforts to optimize inducer usage, guide RNA (gRNA) architecture and combination, and target gene expression level, the highest gene repression efficiency was 30–50% at the protein level and ∼70% at the mRNA level. The moderate RNA knockdown is possibly caused by the collateral cleavage activity toward bystander RNAs, which acts as a mechanism of type IV-D immunity and perturbs microbial metabolism. Further studies on cellular response to CRISPR/Cas13d and improvement in RNA knockdown efficiency are required prior to practical application of this system in microbes.

中文翻译：

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CRISPR/Cas13d 介导的微生物 RNA 敲除

RNA 引导和 RNA 靶向型 IV-D CRISPR/Cas 系统 (CRISPR/Cas13d) 最近已被鉴定并用于哺乳动物和植物细胞中的高效和特异性 RNA 敲除。Cas13d 具有双重 RNase 活性，能够处理 CRISPR 阵列并以独立于原始间隔区侧翼序列 (PFS) 的方式切割目标 RNA。这些特性使该系统成为微生物中多重基因表达调控的有前途的工具。在此，我们旨在为细菌底盘建立一个 CRISPR/Cas13d 介导的 RNA 敲低平台。CasRx, 来自 Ruminococcus flavefaciens XPD3002 的 Cas13d，因其高活性而被选中。然而，发现 CasRx 对大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌都具有高毒性，尤其是当它与其引导和目标 RNA 协同工作时。在使用低拷贝数载体后，通过严格控制的启动子和减弱的核糖体结合位点，我们成功构建了 CasRx 的诱导型表达系统，并将其应用于抑制大肠杆菌中绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。和减弱的核糖体结合位点，我们成功构建了 CasRx 的诱导型表达系统，并将其应用于抑制大肠杆菌中绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。和减弱的核糖体结合位点，我们成功构建了 CasRx 的诱导型表达系统，并将其应用于抑制大肠杆菌中绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。我们成功构建了 CasRx 的诱导型表达系统，并将其应用于抑制大肠杆菌中绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。我们成功构建了 CasRx 的诱导型表达系统，并将其应用于抑制大肠杆菌中绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。大肠杆菌。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。大肠杆菌。尽管我们努力优化诱导剂的使用、引导 RNA (gRNA) 结构和组合以及靶基因表达水平，但最高的基因抑制效率在蛋白质水平上为 30-50%，在 mRNA 水平上为 70%。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。适度的 RNA 敲低可能是由对旁观者 RNA 的侧枝切割活动引起的，它是 IV-D 型免疫和扰乱微生物代谢的机制。在该系统在微生物中的实际应用之前，需要进一步研究细胞对 CRISPR/Cas13d 的反应和提高 RNA 敲低效率。