We have evaluated an NGS-based method to detect recurrent gene fusions of diagnostic and prognostic importance in hematological malignancies. Our goal was to achieve a highly specific assay with a simple workflow, short turnaround time and low cost. The assay uses a commercially available anchored multiplex PCR panel for target enrichment and library preparation, followed by sequencing using a MiSeq instrument. The panel includes all recurrent gene fusions in AML and ALL and is designed to detect gene-specific fusions without prior knowledge of the partner sequence or specific break points. Diagnostic RNA samples from 27 cases with hematological malignancies encompassing 23 different transcript variants were analyzed. In addition, 12 cases from a validation cohort were assessed. All known fusion transcripts were identified with a high degree of confidence, with a large number of reads covering the breakpoints. Importantly, we could identify gene fusions where conventional methods had failed due to cryptic rearrangements or rare fusion partners. The newly-identified fusion partners were verified by RT-PCR and transcript-specific qPCR was designed for patient-specific follow-up. In addition, 12 cases were correctly assessed in a blind test, without prior knowledge of molecular cytogenetics or diagnosis. In summary, our results demonstrate that targeted RNA sequencing using anchored multiplex PCR can be implemented in a clinical laboratory for the detection of recurrent and rare gene fusions in hematological diagnostic samples.

中文翻译：

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在常规诊断中通过靶向RNA测序检测白血病基因融合体。

我们已经评估了基于NGS的方法，以检测对血液恶性肿瘤的诊断和预后重要性的复发性基因融合。我们的目标是通过简单的工作流程，较短的周转时间和低成本来实现高度特异性的测定。该测定使用可商购的锚定多重PCR板进行靶标富集和文库制备，然后使用MiSeq仪器进行测序。该小组包括AML和ALL中的所有复发性基因融合，旨在检测基因特异性融合，而无需事先了解伴侣序列或特定断裂点。分析了来自27例血液恶性肿瘤的诊断性RNA样品，其中包括23种不同的转录物变体。此外，评估了来自验证队列的12例病例。高度可信地鉴定了所有已知的融合转录本，其中大量读物覆盖了断裂点。重要的是，我们可以确定传统方法由于隐式重排或罕见的融合伴侣而失败的基因融合。通过RT-PCR验证了新鉴定的融合伴侣，并设计了转录特异性qPCR用于患者特异性随访。此外，在没有分子细胞遗传学或诊断的先验知识的情况下，通过盲法测试正确评估了12例病例。总之，我们的结果表明，可以在临床实验室中实施使用锚定多重PCR的靶向RNA测序，以检测血液学诊断样品中的复发性和罕见基因融合体。我们可以确定基因融合方法，其中传统方法由于密码重排或罕见的融合伴侣而失败。通过RT-PCR验证了新鉴定的融合伴侣，并设计了转录特异性qPCR用于患者特异性随访。此外，在没有分子细胞遗传学或诊断的先验知识的情况下，通过盲法测试正确评估了12例病例。总之，我们的结果表明，可以在临床实验室中实施使用锚定多重PCR的靶向RNA测序，以检测血液学诊断样品中的复发性和罕见基因融合体。我们可以确定基因融合方法，其中传统方法由于密码重排或罕见的融合伴侣而失败。通过RT-PCR验证了新鉴定的融合伴侣，并设计了转录特异性qPCR用于患者特异性随访。此外，在没有分子细胞遗传学或诊断的先验知识的情况下，通过盲法测试正确评估了12例病例。总之，我们的结果表明，可以在临床实验室中实施使用锚定多重PCR的靶向RNA测序，以检测血液学诊断样品中的复发性和罕见基因融合体。此外，在没有分子细胞遗传学或诊断的先验知识的情况下，通过盲法测试正确评估了12例病例。总之，我们的结果表明，可以在临床实验室中实施使用锚定多重PCR的靶向RNA测序，以检测血液学诊断样品中的复发性和罕见基因融合体。此外，在没有分子细胞遗传学或诊断的先验知识的情况下，通过盲法测试正确评估了12例病例。总之，我们的结果表明，可以在临床实验室中实施使用锚定多重PCR的靶向RNA测序，以检测血液学诊断样品中的复发性和罕见基因融合体。