Proteases with highly specific activities have numerous applications, including the cleavage of affinity tags (Flag; HA; His6X) and solubility promoting partners (GST; MBP) within the context of protein isolation and purification schemes. However, commercially sourced proteases such as Tobacco Etch Virus protease (TEVp) and Human Rhinovirus (HRV) 3C protease are typically applied as single use aliquots, which limits their cost-effectiveness. In addition, the presence of residual proteases in downstream applications can complicate analysis of the protein of interest. Thus, the creation of immobilized, reusable site-specific proteases would be of significant value to the life science community. In this work, we explore two strategies for the immobilization of TEV protease onto superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). In one strategy, a MBP-TEVp-Streptavidin fusion protein is immobilized on biotin-functionalized SPIONs. In a second strategy, TEV protease is covalently coupled onto SPIONs directly, via amine-mediated attachment, and indirectly, via HALO-tag mediated attachment. We demonstrate activity of our immobilized proteases in the presence of a MBP-GFP fusion protein containing the TEV protease target sequence (ENLYFQ|S). We then analyze time-dependent activity, longevity, and reuse of these immobilized protein preparations, comparing each approach. The protease immobilization strategies described in this work may be useful tools for simplifying challenging protein purification protocols, in addition to providing general methods for enzyme immobilization on SPIONs.

具有高特异性活性的蛋白酶具有许多应用，包括在蛋白质分离和纯化方案的背景下切割亲和标签（Flag； HA； His6X）和促进溶解性的伴侣（GST； MBP）。但是，通常将商业来源的蛋白酶（例如烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）和人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶）用作一次性使用的等分试样，这限制了它们的成本效益。此外，下游应用中残留蛋白酶的存在会使目标蛋白质的分析复杂化。因此，固定化的，可重复使用的位点特异性蛋白酶的产生对于生命科学界将具有重大价值。在这项工作中，我们探索将TEV蛋白酶固定在超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）上的两种策略。在一种策略中 MBP-TEVp-链霉亲和素融合蛋白固定在生物素功能化的SPIONs上。在第二种策略中，TEV蛋白酶通过胺介导的附着直接共价偶联到SPIONs上，并通过HALO标签介导的间接间接共价偶联到SPION上。我们在包含TEV蛋白酶靶序列（ENLYFQ | S）的MBP-GFP融合蛋白存在下证明了固定化蛋白酶的活性。然后，我们比较这些固定的蛋白质制剂的时间依赖性活性，寿命和重复使用率，并比较每种方法。除了提供将酶固定在SPIONs上的一般方法外，这项工作中描述的蛋白酶固定策略可能是简化具有挑战性的蛋白质纯化方案的有用工具。TEV蛋白酶通过胺介导的附着直接共价偶联到SPIONs上，并通过HALO标签介导的间接间接共价偶联到SPION上。我们在包含TEV蛋白酶靶序列（ENLYFQ | S）的MBP-GFP融合蛋白存在下证明了固定化蛋白酶的活性。然后，我们比较这些固定的蛋白质制剂的时间依赖性活性，寿命和重复使用率，并比较每种方法。除了提供将酶固定在SPIONs上的一般方法外，这项工作中描述的蛋白酶固定策略可能是简化具有挑战性的蛋白质纯化方案的有用工具。TEV蛋白酶通过胺介导的附着直接共价偶联到SPIONs上，并通过HALO标签介导的间接间接共价偶联到SPION上。我们在包含TEV蛋白酶靶序列（ENLYFQ | S）的MBP-GFP融合蛋白存在下证明了固定化蛋白酶的活性。然后，我们比较这些固定的蛋白质制剂的时间依赖性活性，寿命和重复使用率，并比较每种方法。除了提供将酶固定在SPIONs上的一般方法外，这项工作中描述的蛋白酶固定策略可能是简化具有挑战性的蛋白质纯化方案的有用工具。我们在包含TEV蛋白酶靶序列（ENLYFQ | S）的MBP-GFP融合蛋白存在下证明了固定化蛋白酶的活性。然后，我们比较这些固定的蛋白质制剂的时间依赖性活性，寿命和重复使用率，并比较每种方法。除了提供将酶固定在SPIONs上的一般方法外，这项工作中描述的蛋白酶固定策略可能是简化具有挑战性的蛋白质纯化方案的有用工具。我们在包含TEV蛋白酶靶序列（ENLYFQ | S）的MBP-GFP融合蛋白存在下证明了固定化蛋白酶的活性。然后，我们比较这些固定的蛋白质制剂的时间依赖性活性，寿命和重复使用率，并比较每种方法。除了提供将酶固定在SPIONs上的一般方法外，这项工作中描述的蛋白酶固定策略可能是简化具有挑战性的蛋白质纯化方案的有用工具。