Generation of marker-free transgenic plants is very important to the regulatory permission and commercial release of transgenic crops. Co-transformation methods that enable the removal of selectable marker genes have been extensively used because they are simple and clean. Few comparisons are currently available between different strain/plasmid co-transformation systems, and also data are related to variation in co-transformation frequencies caused by other details of the vector design. In this study, we constructed three vector systems for the co-transformation of allotetraploid Brassica napus (B. napus) mediated by Agrobacterium tumefaciens and compared these co-transformation methods. We tested a mixed-strain system, in which a single T-DNA is harbored in two plasmids, as well as two “double T-DNA” vector systems, in which two independent T-DNAs are harbored in one plasmid in a tandem orientation or in an inverted orientation. As confirmed by the use of PCR analysis, test strips, and Southern blot, the average co-transformation frequencies from these systems ranged from 24 to 81% in T0 plants, with the highest frequency of 81% for 1:1 treatment of the mixed-strain system. These vector systems are valuable for generating marker-free transgenic B. napus plants, and marker-free plants were successfully obtained in the T1 generation from 50 to 77% of T0 transgenic lines using these systems, with the highest frequency of 77% for “double T-DNA” vector systems of pBID RT Enhanced. We further found that marker-free B. napus plants were more frequently encountered in the progeny of transgenic lines which has only one or two marker gene copies in the T0 generation. Two types of herbicide resistant transgenic B. napus plants, Bar+ with phosphinothricin resistance and Bar+EPSPS+GOX+ with phosphinothricin and glyphosate resistance, were obtained. We were successful in removing selectable marker genes in transgenic B. napus plants using all three co-transformation systems developed in this study. It was proved that if a appropriate mole ratio was designed for the specific length ratio of the twin T-DNAs for the mixed-strain method, high unlinked co-insertion frequency and overall success frequency could be achieved. Our study provides useful information for the construction of efficient co-transformation system for marker-free transgenic crop production and developed transgenic B. napus with various types of herbicide resistance.

中文翻译：

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三种农杆菌介导的用于产生无标记转基因欧洲油菜植物的共转化方法的比较。

无标记转基因植物的产生对于转基因作物的监管许可和商业发布非常重要。能够去除可选择标记基因的共转化方法已被广泛使用，因为它们简单且干净。目前在不同的菌株/质粒共转化系统之间几乎没有比较，并且数据与由载体设计的其他细节引起的共转化频率的变化有关。在这项研究中，我们构建了三个载体系统，用于由根癌农杆菌介导的异源四倍体欧洲油菜（B. napus）的共转化，并比较了这些共转化方法。我们测试了一个混合菌株系统，其中单个 T-DNA 包含在两个质粒中，以及两个“双 T-DNA”载体系统，其中两个独立的 T-DNA 以串联方向或反向方向包含在一个质粒中。通过使用 PCR 分析、试纸和 Southern blot 证实，这些系统的平均共转化频率在 T0 植物中为 24% 至 81%，在 1:1 混合处理的最高频率为 81% -应变系统。这些载体系统对于产生无标记转基因欧洲油菜植物很有价值，使用这些系统在T1代成功获得了50%至77%的T0转基因株系的无标记植物，最高频率为77%。 pBID RT 增强的双 T-DNA 载体系统。我们进一步发现，在 T0 代中只有一个或两个标记基因拷贝的转基因品系的后代中更经常遇到无标记的欧洲油菜植物。获得了两种抗除草剂的转基因油菜植物，具有抗草甘膦抗性的 Bar+ 和具有抗草甘膦和草甘膦抗性的 Bar+EPSPS+GOX+。我们使用本研究中开发的所有三种共转化系统成功地去除了转基因欧洲油菜植物中的选择标记基因。事实证明，如果为混合菌株方法的双胞胎T-DNA的特定长度比设计适当的摩尔比，则可以实现较高的非链接共插入频率和整体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。获得了抗草甘膦的 Bar+ 和抗草甘膦的 Bar+EPSPS+GOX+。我们使用本研究中开发的所有三种共转化系统成功地去除了转基因欧洲油菜植物中的选择标记基因。事实证明，如果为混合菌株方法的双胞胎T-DNA的特定长度比设计适当的摩尔比，则可以实现较高的非链接共插入频率和整体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。获得了抗草甘膦的 Bar+ 和抗草甘膦的 Bar+EPSPS+GOX+。我们使用本研究中开发的所有三种共转化系统成功地去除了转基因欧洲油菜植物中的选择标记基因。事实证明，如果为混合菌株方法的双胞胎T-DNA的特定长度比设计适当的摩尔比，则可以实现较高的非链接共插入频率和整体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。我们使用本研究中开发的所有三种共转化系统成功地去除了转基因欧洲油菜植物中的选择标记基因。事实证明，如果为混合菌株方法的双胞胎T-DNA的特定长度比设计适当的摩尔比，则可以实现较高的非链接共插入频率和整体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。我们使用本研究中开发的所有三种共转化系统成功地去除了转基因欧洲油菜植物中的选择标记基因。事实证明，如果为混合菌株方法的双胞胎T-DNA的特定长度比设计适当的摩尔比，则可以实现较高的非链接共插入频率和整体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。可以实现高非链接共插入频率和总体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。可以实现高非链接共插入频率和总体成功频率。我们的研究为构建高效的无标记转基因作物生产共转化系统提供了有用的信息，并开发了具有各种除草剂抗性的转基因油菜。