Transcription factor IIH (TFIIH) plays essential roles in both the initiation of RNA Polymerase II-mediated transcription and the Nucleotide Excision Repair (NER) pathway in eukaryotes. In NER, the 7-subunit TFIIH Core sub-complex is responsible for the opening and extension of the DNA bubble created at the lesion site, utilizing the molecular motors XPB and XPD. Mutations in Core subunits are associated with a series of severe autosomal recessive disorders characterised by symptoms such as mild-to-extreme photosensitivity, premature ageing, physical and neurological anomalies, and in some cases an increased susceptibility to cancer. Although TFIIH Core has been successfully obtained in the past, the process has always remained challenging and laborious, involving many steps that severely hindered the amount of pure, active complex obtained. This has limited biochemical and functional studies of the NER process. Here we describe improved and simplified processes for the cloning, expression and purification of the 7-subunit TFIIH Core sub-complex. The combined use of auto-cleavable 2A-like sequences derived from the Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) and the MultiBac™ cloning system, a powerful baculoviral expression vector specifically conceived for the obtaining of multi-subunit eukaryotic complexes, allowed us to obtain a single, 7-gene plasmid in a short time using regular restriction cloning strategies. Additionally, expression of the construct in High Five™ insect cells paired with a simple 5-step purification protocol allowed the extraction of a pure, active TFIIH Core sub-complex in milligram quantities.

转录因子IIH（TFIIH）在真核生物中RNA聚合酶II介导的转录起始和核苷酸切除修复（NER）途径中都起着重要作用。在NER中，利用分子马达XPB和XPD，由7个亚基TFIIH Core亚复合体负责打开和扩展在病变部位产生的DNA气泡。核心亚基的突变与一系列严重的常染色体隐性遗传疾病有关，这些疾病的特征是轻度至极度的光敏性，过早衰老，身体和神经系统异常，在某些情况下还增加了对癌症的易感性。尽管TFIIH Core过去已成功获得，但该方法始终具有挑战性和费力，涉及许多步骤，严重阻碍了获得的纯净，活性复合物的量。这限制了NER过程的生化和功能研究。在这里，我们描述了7亚基TFIIH Core亚复合物的克隆，表达和纯化的改进和简化过程。源自口蹄疫病毒（FMDV）和MultiBac™克隆系统的可自动切割的2A样序列的组合使用，这是一种功能强大的杆状病毒表达载体，专为获得多亚基真核复合体而设计使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得单个7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。在这里，我们描述了7亚基TFIIH Core亚复合物的克隆，表达和纯化的改进和简化过程。源自口蹄疫病毒（FMDV）和MultiBac™克隆系统的可自动切割的2A样序列的组合使用，这是一种功能强大的杆状病毒表达载体，专为获得多亚基真核复合体而设计使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得单个7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。在这里，我们描述了7亚基TFIIH Core亚复合物的克隆，表达和纯化的改进和简化过程。源自口蹄疫病毒（FMDV）和MultiBac™克隆系统的可自动切割的2A样序列的组合使用，这是一种功能强大的杆状病毒表达载体，专为获得多亚基真核复合体而设计使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得单个7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。源自口蹄疫病毒（FMDV）和MultiBac™克隆系统的可自动切割的2A样序列的组合使用，这是一种功能强大的杆状病毒表达载体，专为获得多亚基真核复合体而设计使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得单个7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。源自口蹄疫病毒（FMDV）和MultiBac™克隆系统的可自动切割的2A样序列的组合使用，这是一种功能强大的杆状病毒表达载体，专为获得多亚基真核复合体而设计使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得单个7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。使用常规限制性克隆策略可在短时间内获得7基因质粒。此外，在High Five™昆虫细胞中表达该构建体并与简单的5步纯化方案配对后，就可以提取出毫克量的纯净，活性TFIIH Core亚复合物。