Covalent modifications by reactive oxygen species can modulate the function and stability of proteins. Thermal unfolding experiments in solution are a standard tool for probing oxidation-induced stability changes. Complementary to such solution investigations, the stability of electrosprayed protein ions can be assessed in the gas phase by collision-induced unfolding (CIU) and ion-mobility spectrometry. A question that remains to be explored is whether oxidation-induced stability alterations in solution are mirrored by the CIU behavior of gaseous protein ions. Here, we address this question using chloramine-T-oxidized cytochrome c (CT-cyt c) as a model system. CT-cyt c comprises various proteoforms that have undergone MetO formation (+16 Da) and Lys carbonylation (LysCH2-NH2 → LysCHO, -1 Da). We found that CT-cyt c in solution was destabilized, with a ∼5 °C reduced melting temperature compared to unmodified controls. Surprisingly, CIU experiments revealed the opposite trend, i.e., a stabilization of CT-cyt c in the gas phase. To pinpoint the source of this effect, we performed proteoform-resolved CIU on CT-cyt c fractions that had been separated by cation exchange chromatography. In this way, it was possible to identify MetO formation at residue 80 as the key modification responsible for stabilization in the gas phase. Possibly, this effect is caused by newly formed contacts of the sulfoxide with aromatic residues in the protein core. Overall, our results demonstrate that oxidative modifications can affect protein stability in solution and in the gas phase very differently.

中文翻译：

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探究多相氧化修饰对溶液和气相中细胞色素 c 稳定性的影响。

活性氧的共价修饰可以调节蛋白质的功能和稳定性。溶液中的热解折叠实验是探测氧化引起的稳定性变化的标准工具。作为此类溶液研究的补充，电喷雾蛋白质离子的稳定性可以通过碰撞诱导解折叠 (CIU) 和离子迁移谱在气相中进行评估。一个仍有待探索的问题是溶液中氧化诱导的稳定性变化是否反映在气态蛋白质离子的 CIU 行为中。在这里，我们使用氯胺-T 氧化的细胞色素 c (CT-cyt c) 作为模型系统来解决这个问题。CT-cyt c 包含经过 MetO 形成 (+16 Da) 和 Lys 羰基化 (LysCH2-NH2 → LysCHO, -1 Da) 的各种蛋白型。我们发现溶液中的 CT-cyt c 不稳定，与未修改的对照相比，熔化温度降低了约 5°C。令人惊讶的是，CIU 实验揭示了相反的趋势，即气相中 CT-cyt c 的稳定化。为了查明这种影响的来源，我们对通过阳离子交换色谱分离的 CT-cyt c 级分进行了蛋白型分离 CIU。通过这种方式，可以确定残留物 80 处的 MetO 形成是负责气相稳定的关键改性。可能这种效应是由亚砜与蛋白质核心中的芳香族残基新形成的接触引起的。总体而言，我们的结果表明，氧化修饰可以非常不同地影响溶液和气相中的蛋白质稳定性。CIU 实验揭示了相反的趋势，即气相中 CT-cyt c 的稳定化。为了查明这种影响的来源，我们对通过阳离子交换色谱分离的 CT-cyt c 级分进行了蛋白型分离 CIU。通过这种方式，可以确定残留物 80 处的 MetO 形成是负责气相稳定的关键改性。可能这种效应是由亚砜与蛋白质核心中的芳香族残基新形成的接触引起的。总体而言，我们的结果表明，氧化修饰可以非常不同地影响溶液和气相中的蛋白质稳定性。CIU 实验揭示了相反的趋势，即气相中 CT-cyt c 的稳定化。为了查明这种影响的来源，我们对通过阳离子交换色谱分离的 CT-cyt c 级分进行了蛋白型分离 CIU。通过这种方式，可以确定残留物 80 处的 MetO 形成是负责气相稳定的关键改性。可能这种效应是由亚砜与蛋白质核心中的芳香族残基新形成的接触引起的。总体而言，我们的结果表明，氧化修饰可以非常不同地影响溶液和气相中的蛋白质稳定性。我们对通过阳离子交换色谱分离的 CT-cyt c 级分进行了蛋白型分离 CIU。通过这种方式，可以确定残留物 80 处的 MetO 形成是负责气相稳定的关键改性。可能这种效应是由亚砜与蛋白质核心中的芳香族残基新形成的接触引起的。总体而言，我们的结果表明，氧化修饰可以非常不同地影响溶液和气相中的蛋白质稳定性。我们对通过阳离子交换色谱分离的 CT-cyt c 级分进行了蛋白型分离 CIU。通过这种方式，可以确定残留物 80 处的 MetO 形成是负责气相稳定的关键改性。可能这种效应是由亚砜与蛋白质核心中的芳香族残基新形成的接触引起的。总体而言，我们的结果表明，氧化修饰可以非常不同地影响溶液和气相中的蛋白质稳定性。