Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a powerful tool for modelling human development. In recent years, hPSCs have become central in cell-based therapies for neurodegenerative diseases given their potential to replace affected neurons. However, directing hPSCs into specific neuronal types is complex and requires an accurate protocol that mimics endogenous neuronal development. Here we describe step-by-step a fast feeder-free neuronal differentiation protocol to direct hPSCs to mature forebrain neurons in 37 days in vitro (DIV). The protocol is based upon a combination of specific morphogens, trophic and growth factors, ions, neurotransmitters and extracellular matrix elements. A human-induced PSC line (Ctr-Q33) and a human embryonic stem cell line (GEN-Q18) were used to reinforce the potential of the protocol. Neuronal activity was analysed by single-cell calcium imaging. At 8 DIV, we obtained a homogeneous population of hPSC-derived neuroectodermal progenitors which self-arranged in bi-dimensional neural tube-like structures. At 16 DIV, we generated hPSC-derived neural progenitor cells (NPCs) with mostly a subpallial identity along with a subpopulation of pallial NPCs. Terminal in vitro neuronal differentiation was confirmed by the expression of microtubule associated protein 2b (Map 2b) by almost 100% of hPSC-derived neurons and the expression of specific-striatal neuronal markers including GABA, CTIP2 and DARPP-32. HPSC-derived neurons showed mature and functional phenotypes as they expressed synaptic markers, voltage-gated ion channels and neurotransmitter receptors. Neurons displayed diverse spontaneous activity patterns that were classified into three major groups, namely "high", "intermediate" and "low" firing neurons. Finally, transplantation experiments showed that the NPCs survived and differentiated within mouse striatum for at least 3 months. NPCs integrated host environmental cues and differentiated into striatal medium-sized spiny neurons (MSNs), which successfully integrated into the endogenous circuitry without teratoma formation. Altogether, these findings demonstrate the potential of this robust human neuronal differentiation protocol, which will bring new opportunities for the study of human neurodevelopment and neurodegeneration, and will open new avenues in cell-based therapies, pharmacological studies and alternative in vitro toxicology.

中文翻译：

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人多能干细胞衍生的神经元在体外功能成熟，并在移植后整合到小鼠纹状体中。

人类多能干细胞（hPSC）是用于模拟人类发育的强大工具。近年来，由于hPSC具有取代受影响的神经元的潜力，因此它们已成为神经退行性疾病基于细胞疗法的中心。但是，将hPSC定向到特定的神经元类型是复杂的，并且需要模拟内源性神经元发育的精确方案。在这里，我们描述了在37天的体外（DIV）中将hPSC定向到成熟的前脑神经元的快速无饲养者神经元分化方案。该协议基于特定形态发生子，营养和生长因子，离子，神经递质和细胞外基质元素的组合。使用人类诱导的PSC系（Ctr-Q33）和人类胚胎干细胞系（GEN-Q18）来增强方案的潜力。通过单细胞钙成像分析神经元活性。在8 DIV，我们获得了hPSC衍生的神经外胚层祖细胞的同质群体，这些祖细胞在二维神经管样结构中自我排列。在第16个DIV时，我们生成了hPSC衍生的神经祖细胞（NPC），该细胞具有大部分为睑下身份，以及一部分为睑下NPC。几乎100％的hPSC来源的神经元表达了微管相关蛋白2b（图2b），以及特异性纹状体神经元标记物（包括GABA，CTIP2和DARPP-32）的表达证实了终末体外神经元分化。HPSC衍生的神经元表现出成熟的功能表型，因为它们表达突触标记，电压门控离子通道和神经递质受体。神经元显示出多种自发活动模式，这些活动模式可分为三个主要组，即“高”，“中”和“低”发射神经元。最后，移植实验表明，NPC在小鼠纹状体内存活并分化了至少3个月。NPC整合了宿主环境的线索，并分化为纹状体中等大小的多刺神经元（MSNs），这些神经元成功地整合到了内源性回路中而没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。即“高”，“中”和“低”发射神经元。最后，移植实验表明，NPC在小鼠纹状体中存活并分化了至少3个月。NPC整合了宿主环境的线索，并分化为纹状体中等大小的多刺神经元（MSNs），这些神经元成功地整合到了内源性回路中而没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。即“高”，“中”和“低”发射神经元。最后，移植实验表明，NPC在小鼠纹状体内存活并分化了至少3个月。NPC整合了宿主的环境线索，并分化为纹状体中等大小的多刺神经元（MSNs），这些神经元已成功整合到内源性回路中，而没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。移植实验表明，NPC在小鼠纹状体中存活并分化了至少3个月。NPC整合了宿主环境的线索，并分化为纹状体中等大小的多刺神经元（MSNs），这些神经元成功地整合到了内源性回路中而没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。移植实验表明，NPC在小鼠纹状体中存活并分化了至少3个月。NPC整合了宿主环境的线索，并分化为纹状体中等大小的多刺神经元（MSNs），这些神经元成功地整合到了内源性回路中而没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。它成功整合到内源性电路中，没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。它成功整合到内源性电路中，没有畸胎瘤形成。总而言之，这些发现证明了这种强大的人类神经元分化方案的潜力，这将为研究人类神经发育和神经变性带来新的机会，并将为基于细胞的疗法，药理学研究和替代的体外毒理学打开新的途径。