We present on-chip implementation of an isothermal nucleic acid amplification assay with optomagnetic detection. Isothermal rolling circle amplification (RCA) was designed for the highly specific detection of a single point mutation in the subsequence of the katG catalase peroxidase gene responsible for resistance against the antibiotic isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. The assay was integrated using streptavidin-coated magnetic microbeads (MMBs) as a movable substrate to transport the synthetic katG target and products between the sequential processing steps. RCA products were detected via optomagnetic measurements of the binding of functionalized magnetic nanoparticles (MNPs). Binding of MNPs to RCA products leads to an increase of their hydrodynamic size and consequently a shift of the optomagnetic signal to lower frequencies. We first analyzed the affinity of DNA probes used for target capture on MMBs and binding of MNPs to RCA products, respectively. This enabled us to choose conditions where amplification products were released from the MMBs and where their binding to MNPs was optimal. The optimized assay was transferred to a polymer chip with three connected chambers filled with reaction buffers for capture, RCA, and detection. The chip was operated in a setup integrating temperature control, transport of the DNA on magnetic carriers, and dose-dependent detection of MNP clustering. For a total assay time of about 2 h, we demonstrate specific detection of the antibiotic resistance in a synthetic tuberculosis DNA target with a detection limit of 4 pM.

中文翻译：

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基于滚环扩增产物诱导的磁性纳米颗粒聚集的结核病芯片上 DNA 分析

我们介绍了具有光磁检测的等温核酸扩增测定的片上实现。等温滚环扩增 (RCA) 旨在高度特异性检测 katG 过氧化氢酶过氧化物酶基因子序列中的单点突变，该基因负责对结核分枝杆菌中的抗生素异烟肼产生抗性。该测定使用链霉亲和素包被的磁微珠 (MMB) 作为可移动的基材进行整合，以在顺序处理步骤之间运输合成 katG 目标和产品。通过功能化磁性纳米粒子 (MNP) 结合的光磁测量检测 RCA 产物。MNP 与 RCA 产物的结合导致其流体动力学尺寸的增加，从而导致光磁信号向较低频率的转变。我们首先分别分析了用于在 MMB 上捕获目标的 DNA 探针的亲和力以及 MNP 与 RCA 产物的结合。这使我们能够选择从 MMB 中释放扩增产物以及它们与 MNP 结合最佳的条件。将优化的测定转移到具有三个连接室的聚合物芯片上，该室充满反应缓冲液用于捕获、RCA 和检测。该芯片在集成温度控制、磁性载体上 DNA 传输和 MNP 聚类的剂量依赖性检测的设置中运行。对于大约 2 小时的总检测时间，我们证明了对合成结核病 DNA 靶标中抗生素耐药性的特异性检测，检测限为 4 pM。这使我们能够选择从 MMB 中释放扩增产物以及它们与 MNP 结合最佳的条件。优化的分析被转移到一个聚合物芯片上，该芯片具有三个连接的腔室，腔室充满了用于捕获、RCA 和检测的反应缓冲液。该芯片在集成温度控制、磁性载体上 DNA 传输和 MNP 聚类的剂量依赖性检测的设置中运行。对于大约 2 小时的总检测时间，我们证明了对合成结核病 DNA 靶标中抗生素耐药性的特异性检测，检测限为 4 pM。这使我们能够选择从 MMB 中释放扩增产物以及它们与 MNP 结合最佳的条件。优化的分析被转移到一个聚合物芯片上，该芯片具有三个连接的腔室，腔室充满了用于捕获、RCA 和检测的反应缓冲液。该芯片在集成温度控制、磁性载体上 DNA 传输和 MNP 聚类的剂量依赖性检测的设置中运行。对于大约 2 小时的总检测时间，我们证明了对合成结核病 DNA 靶标中抗生素耐药性的特异性检测，检测限为 4 pM。将优化的测定转移到具有三个连接室的聚合物芯片中，该室充满反应缓冲液用于捕获、RCA 和检测。该芯片在集成温度控制、磁性载体上 DNA 传输和 MNP 聚类的剂量依赖性检测的设置中运行。对于大约 2 小时的总检测时间，我们证明了对合成结核病 DNA 靶标中抗生素耐药性的特异性检测，检测限为 4 pM。优化的分析被转移到一个聚合物芯片上，该芯片具有三个连接的腔室，腔室充满了用于捕获、RCA 和检测的反应缓冲液。该芯片在集成温度控制、磁性载体上 DNA 传输和 MNP 聚类的剂量依赖性检测的设置中运行。对于大约 2 小时的总检测时间，我们证明了对合成结核病 DNA 靶标中抗生素耐药性的特异性检测，检测限为 4 pM。