A real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the detection of Muscovy duck reovirus (MDRV) RNA in clinical samples is described. The assay is based on TaqMan-MGB technology, consisting of two primers and one probe labeled with the reporter dye 6-carboxyfluorescein that binds selectively to the sigma B-protein gene of MDRV. This technique also includes an Internal Positive Control (IPC). The real-time RT-PCR assay was able to detect MDRVs, whereas other common waterfowl-origin viral pathogens were not recognised by the established oligonucleotide set, thus showing that the test was specific for MDRV. The sensitivity of the assay was 2.83 × 101 copies/μL and was 100 times higher than that of the conventional RT-PCR. The variation coefficients of intra-assay and inter-assay were less than 1.5% which verified sufficient repeatability of this assay. The use of β-actin mRNA as an IPC in order not to reduce the efficiency of the assay was adopted. The detection for 100 clinical samples showed that the positive rate of the established TaqMan-MGB real-time RT-PCR method was 87% (87/100), while the positive rate of the conventional RT-PCR was 83% (83/100), with the coincidence rate was 97.14%. Sensitivity and positive rate for clinical samples of TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR were higher than conventional RT-PCR. The high specificity, sensitivity, and rapidity TaqMan-MGB real-time RT-PCR assay with the use of IPC to monitor for false negative results can make this method suitable for the pathogenic surveillance and epidemiological investigation of MDRV infection.

中文翻译：

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TaqMan-MGB实时RT-PCR分析法，带有内部扩增对照，可快速检测番鸭呼肠孤病毒。

描述了一种实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），用于检测临床样本中的番鸭呼肠孤病毒（MDRV）RNA。该测定基于TaqMan-MGB技术，由两个引物和一个标记有报告染料6-羧基荧光素的探针组成，该染料选择性地与MDRV的σB蛋白基因结合。此技术还包括内部阳性对照（IPC）。实时RT-PCR检测能够检测MDRV，而其他常见的水禽起源病毒病原体却无法被已建立的寡核苷酸组识别，因此表明该检测对MDRV具有特异性。该方法的灵敏度为2.83×101拷贝/μL，比常规RT-PCR高100倍。批内和批间变异系数均小于1。5％，证实该测定法具有足够的可重复性。为了不降低测定效率，采用了β-肌动蛋白mRNA作为IPC。对100个临床样品的检测表明，已建立的TaqMan-MGB实时RT-PCR方法的阳性率为87％（87/100），而常规RT-PCR的阳性率为83％（83/100） ），符合率为97.14％。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。为了不降低测定效率，采用了β-肌动蛋白mRNA作为IPC。对100个临床样品的检测表明，已建立的TaqMan-MGB实时RT-PCR方法的阳性率为87％（87/100），而常规RT-PCR的阳性率为83％（83/100） ），符合率为97.14％。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。为了不降低测定效率，采用了β-肌动蛋白mRNA作为IPC。对100个临床样品的检测表明，已建立的TaqMan-MGB实时RT-PCR方法的阳性率为87％（87/100），而常规RT-PCR的阳性率为83％（83/100） ），符合率为97.14％。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。对100个临床样品的检测表明，已建立的TaqMan-MGB实时RT-PCR方法的阳性率为87％（87/100），而常规RT-PCR的阳性率为83％（83/100） ），符合率为97.14％。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。对100个临床样品的检测表明，已建立的TaqMan-MGB实时RT-PCR方法的阳性率为87％（87/100），而常规RT-PCR的阳性率为83％（83/100） ），符合率为97.14％。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，使用IPC监测假阴性结果可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。TaqMan荧光定量RT-PCR的临床样品的灵敏度和阳性率均高于常规RT-PCR。TaqMan-MGB实时RT-PCR测定法具有很高的特异性，灵敏度和快速性，并使用IPC监测假阴性结果，可使该方法适用于MDRV感染的病原学监测和流行病学调查。