The S-specific pollen rejection response in Nicotiana depends on the interaction between S-RNase and a suite of SLF proteins. However, the biochemical pathway requires other essential proteins. One of them is the stigmatic protein NaStEP, which belongs to the Kunitz-type protease inhibitor family. Within the pollen tubes, NaStEP is a positive regulator of HT-B stability, likely inhibiting its degradation and, additionally, interacts with NaSIPP, a mitochondrial phosphate carrier. To gain a deeper understanding of the biochemical role of NaStEP in pollen rejection, we evaluated whether the activity of NaStEP as protease inhibitor is specific to a particular type of protease and whether it has the function of a voltage-dependent channel (VDC) blocker. Our findings indicate that, in vitro, NaStEP inhibits a subtilisin-like protease in an irreversible manner, but not other proteases, such as thermolysin and papain. Furthermore, we found that subtilisin processes the native NaStEP (24 kDa) into two lower molecular weight peptides of 21 and 14 kDa. Moreover, when we incubated NaStEP along with Xenopus leavis oocytes expressing the voltage-dependent potassium channel Kv 1.3, the current was blocked, indicating that NaStEP acts as a VDC blocker. These data allow us to propose NaStEP acts as a key molecule with two functions, one protecting HT-B from degradation by inhibiting a subtilisin-like protease and the second one by forming a complex with a mitochondrial VDC that could destabilize the mitochondria to trigger cell death, which would reinforce S-specific pollen rejection in Nicotiana.

中文翻译：

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NaStEP是烟草中自我不相容的必需蛋白，具有双重作用，既可作为蛋白酶抑制剂，又可以作为电压依赖性通道阻滞剂。

烟草中的S特异性花粉排斥反应取决于S-RNase和一组SLF蛋白之间的相互作用。但是，生化途径还需要其他必需蛋白质。其中之一是带象头的蛋白质NaStEP，它属于Kunitz型蛋白酶抑制剂家族。在花粉管中，NaStEP是HT-B稳定性的正向调节剂，可能会抑制其降解，并与线粒体磷酸盐载体NaSIPP相互作用。为了更深入了解NaStEP在花粉排斥中的生化作用，我们评估了NaStEP作为蛋白酶抑制剂的活性是否对特定类型的蛋白酶具有特异性，以及它是否具有电压依赖性通道（VDC）阻断剂的功能。我们的发现表明，在体外，NaStEP以不可逆的方式抑制枯草杆菌蛋白酶样的蛋白酶，但不抑制其他蛋白酶，例如嗜热菌蛋白酶和木瓜蛋白酶。此外，我们发现枯草杆菌蛋白酶将天然NaStEP（24 kDa）加工成两个21和14 kDa的低分子量肽。此外，当我们将NaStEP与表达电压依赖性钾通道Kv 1.3的非洲蟾蜍卵母细胞一起孵育时，电流被阻断，表明NaStEP充当VDC阻断剂。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。如嗜热菌素和木瓜蛋白酶。此外，我们发现枯草杆菌蛋白酶将天然NaStEP（24 kDa）加工成两个21和14 kDa的低分子量肽。此外，当我们将NaStEP与表达电压依赖性钾通道Kv 1.3的非洲蟾蜍卵母细胞一起孵育时，电流被阻断，表明NaStEP充当VDC阻断剂。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将加强烟草中S特异的花粉排斥。如嗜热菌素和木瓜蛋白酶。此外，我们发现枯草杆菌蛋白酶将天然NaStEP（24 kDa）加工成两个21和14 kDa的低分子量肽。此外，当我们将NaStEP与表达电压依赖性钾通道Kv 1.3的非洲蟾蜍卵母细胞一起孵育时，电流被阻断，表明NaStEP充当VDC阻断剂。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。我们发现枯草杆菌蛋白酶将天然NaStEP（24 kDa）加工成两个21和14 kDa的低分子量肽。此外，当我们将NaStEP与表达电压依赖性钾通道Kv 1.3的非洲蟾蜍卵母细胞一起孵育时，电流被阻断，表明NaStEP充当VDC阻断剂。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。我们发现枯草杆菌蛋白酶将天然NaStEP（24 kDa）加工成两个21和14 kDa的低分子量肽。此外，当我们将NaStEP与表达电压依赖性钾通道Kv 1.3的非洲蟾蜍卵母细胞一起孵育时，电流被阻断，表明NaStEP充当VDC阻断剂。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。指示NaStEP充当VDC阻止程序。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。指示NaStEP充当VDC阻止程序。这些数据使我们建议NaStEP充当具有两个功能的关键分子，一个功能是通过抑制枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶来保护HT-B免受降解，第二个功能是与线粒体VDC形成复合物，该复合物可能破坏线粒体以触发细胞死亡，这将增强烟草中S特异的花粉排斥。