Recombinant expression and purification of proteins is key for biochemical and biophysical investigations. Although this has become a routine and standard procedure for many proteins, intrinsically disordered ones and those with low complexity sequences pose difficulties. Proteins containing low complexity regions (LCRs) are increasingly becoming significant for their roles in both normal and pathological processes. Here, we report cloning, expression and purification of N-terminal LCR of RanBP9 protein (Nt-RanBP9). RanBP9 is a scaffolding protein present in both cytoplasm and nucleus that is implicated in many cellular processes. Nt-RanBP9 is a poorly understood region of the protein perhaps due to difficulties posed by the LCR. Indeed, conventional methods presented difficulties in Nt-RanBP9 cloning due to its high GC content resulting in insignificant protein expression. These led us to use a different approach of cloning by expressing the protein as a fusion construct containing mCherry or mEGFP using in vivo DNA recombination methods. Our results indicate that expression of mEGFP-tagged Nt-RanBP9 followed by thrombin cleavage of the tag was the most effective method to obtain the protein with >90% purity and good yields. We report and discuss the challenges in obtaining the N-terminal region of RanBP9, a protein with functional implications in multiple biological processes and neurodegenerative diseases.

中文翻译：

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RanBP9蛋白低复杂度区域的克隆、表达和纯化。

蛋白质的重组表达和纯化是生化和生物物理研究的关键。尽管这已成为许多蛋白质的常规和标准程序，但本质上无序的蛋白质和具有低复杂性序列的蛋白质会带来困难。含有低复杂性区域 (LCR) 的蛋白质因其在正常和病理过程中的作用而变得越来越重要。在这里，我们报告了 RanBP9 蛋白 (Nt-RanBP9) N 端 LCR 的克隆、表达和纯化。RanBP9 是一种存在于细胞质和细胞核中的支架蛋白，与许多细胞过程有关。Nt-RanBP9 是蛋白质的一个知之甚少的区域，可能是由于 LCR 带来的困难。的确，常规方法在 Nt-RanBP9 克隆中存在困难，因为其高 GC 含量导致蛋白质表达不显着。这些导致我们使用不同的克隆方法，通过使用体内 DNA 重组方法将蛋白质表达为包含 mCherry 或 mEGFP 的融合构建体。我们的结果表明，mEGFP 标记的 Nt-RanBP9 的表达以及标记的凝血酶切割是获得纯度 > 90% 和良好产量的蛋白质的最有效方法。我们报告并讨论了获得 RanBP9 的 N 端区域的挑战，RanBP9 是一种在多种生物过程和神经退行性疾病中具有功能意义的蛋白质。这些导致我们使用不同的克隆方法，通过使用体内 DNA 重组方法将蛋白质表达为包含 mCherry 或 mEGFP 的融合构建体。我们的结果表明，mEGFP 标记的 Nt-RanBP9 的表达以及标记的凝血酶切割是获得纯度 > 90% 和良好产量的蛋白质的最有效方法。我们报告并讨论了获得 RanBP9 的 N 端区域的挑战，RanBP9 是一种在多种生物过程和神经退行性疾病中具有功能意义的蛋白质。这些导致我们使用不同的克隆方法，通过使用体内 DNA 重组方法将蛋白质表达为包含 mCherry 或 mEGFP 的融合构建体。我们的结果表明，mEGFP 标记的 Nt-RanBP9 的表达以及标记的凝血酶切割是获得纯度 > 90% 和良好产量的蛋白质的最有效方法。我们报告并讨论了获得 RanBP9 的 N 端区域的挑战，RanBP9 是一种在多种生物过程和神经退行性疾病中具有功能意义的蛋白质。