Cell-free protein expression has become a widely used alternative of in vivo, cell-based systems in functional and structural studies of proteins. The wheat germ-based method outstands from the commercially available eukaryotic in vitro translation systems by its flexibility, high translation efficiency and success rate of properly folded eukaryotic protein synthesis. The original T7 promoter containing pEU3-NII vector was improved previously by addition of a ligation-independent cloning site, His6- and GST-tags, and a TEV protease cleavage site to facilitate the creation of recombinant plasmids, permit affinity purification, and enable production of purified, tag-free target proteins, respectively. Here, we describe a further development of pEU3-NII vector by inserting the rare-cutting, NotI restriction enzyme cleavage site to simplify vector linearization step prior to in vitro transcription. Additionally, His12, FLAG, and Halo affinity tag coding vectors have been created to increase detection sensitivity, specificity of interaction studies, and provide covalently linkable ligands for pull-down assays, respectively. Finally, the presented GST-His6, and GST-biotin double-tagging vectors could broaden the range of possibilities of protein-protein interaction studies. The new generation of pEU3-NII vector family allows a more rapid production of translationally active mRNA and wheat germ cell-free expression of target proteins with a wide variety of affinity tags thus enables designing flexible and diverse experimental arrangement for in vitro studies of proteins.

中文翻译：

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具有多个亲和标签的新型表达载体家族，用于小麦胚无细胞蛋白表达

在蛋白质的功能和结构研究中，无细胞蛋白质表达已成为体内基于细胞的系统的一种广泛使用的替代方法。基于小麦胚芽的方法以其灵活性，高翻译效率和正确折叠的真核蛋白质合成的成功率，从市售的真核生物体外翻译系统中脱颖而出。通过添加不依赖连接的克隆位点，His6-和GST标签以及TEV蛋白酶切割位点来改善包含原始T7启动子的pEU3-NII载体，以促进重组质粒的产生，亲和纯化并能够生产纯化的无标签靶蛋白。在这里，我们介绍了通过插入稀切片段，进一步开发pEU3-NII载体的方法，NotI限制性酶切位点可简化体外转录之前的载体线性化步骤。此外，已创建His12，FLAG和Halo亲和标签编码载体，以提高检测灵敏度，相互作用研究的特异性，并分别为下拉测定法提供可共价连接的配体。最后，提出的GST-His6和GST-生物素双标签载体可以拓宽蛋白质-蛋白质相互作用研究的可能性范围。新一代的pEU3-NII载体家族可以更快速地产生具有多种亲和标签的翻译活性mRNA，并实现无目标基因的小麦胚芽无细胞表达，因此可以为蛋白质的体外研究设计灵活多样的实验安排。已经创建了FLAG和Halo亲和标签编码载体，以提高检测灵敏度，相互作用研究的特异性，并分别为下拉测定法提供可共价连接的配体。最后，提出的GST-His6和GST-生物素双标签载体可以拓宽蛋白质相互作用研究的范围。新一代的pEU3-NII载体家族可以更快速地产生具有多种亲和标签的翻译活性mRNA，并实现无目标基因的小麦胚芽无细胞表达，因此可以为蛋白质的体外研究设计灵活多样的实验安排。已经创建了FLAG和Halo亲和标签编码载体，以提高检测灵敏度，相互作用研究的特异性，并分别为下拉测定法提供可共价连接的配体。最后，提出的GST-His6和GST-生物素双标签载体可以拓宽蛋白质-蛋白质相互作用研究的可能性范围。新一代的pEU3-NII载体家族可以更快速地产生具有多种亲和标签的翻译活性mRNA，并实现无目标基因的小麦胚芽无细胞表达，因此可以为蛋白质的体外研究设计灵活多样的实验安排。分别。最后，提出的GST-His6和GST-生物素双标签载体可以拓宽蛋白质-蛋白质相互作用研究的可能性范围。新一代的pEU3-NII载体家族可以更快速地产生具有多种亲和标签的翻译活性mRNA，并实现无目标基因的小麦胚芽无细胞表达，因此可以为蛋白质的体外研究设计灵活多样的实验安排。分别。最后，提出的GST-His6和GST-生物素双标签载体可以拓宽蛋白质-蛋白质相互作用研究的可能性范围。新一代的pEU3-NII载体家族可以更快速地产生具有多种亲和标签的翻译活性mRNA，并实现无目标基因的小麦胚芽无细胞表达，因此可以为蛋白质的体外研究设计灵活多样的实验安排。