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High-copy genome integration of 2,3-butanediol biosynthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae via in vivo DNA assembly and replicative CRISPR-Cas9 mediated delta integration.
Journal of Biotechnology ( IF 4.1 ) Pub Date : 2020-01-29 , DOI: 10.1016/j.jbiotec.2020.01.014 Shuangcheng Huang 1 , Anli Geng 1
Journal of Biotechnology ( IF 4.1 ) Pub Date : 2020-01-29 , DOI: 10.1016/j.jbiotec.2020.01.014 Shuangcheng Huang 1 , Anli Geng 1
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CRISPR Cas9 system is becoming an emerging genome-editing platform and has been widely used for multiplex genome engineering of Saccharomyces cerevisiae. In this study, we developed a novel replicative and integrative CRISPR Cas9 genome-editing platform for large DNA construct in vivo assembly, replication, and high-copy genome integration in Saccharomyces cerevisiae. It harnessed advantages of autonomous replicative sequence in S. cerevisiae, in vivo DNA assembly, CRISPR Cas9, and delta integration. Enhanced green fluorescent protein was used as a marker to confirm large DNA construct in vivo assembly and genome integration. Based on this platform, an efficient 2,3- BDO producing yeast strain was rapidly constructed with up to 25-copy genome integration of 2,3-BDO biosynthesis pathway. Further strain engineering was conducted by multiplex disruption of ADH1, PDC1, PDC5 and MTH1 using a 2μ-based replicative CRISPR Cas9 plasmid containing donor DNAs. As a result, the 2,3-BDO titer was improved by 3.9 folds compared to that obtained by the initially engineered yeast and 50.5 g/L 2,3-BDO was produced by the final engineered yeast strain 36aS5-CFBDO in fed-batch fermentation without strain evolution and process optimization. This study demonstrated that the new replicative and integrative CRISPR Cas9 genome-editing platform was promising in generating an efficient 2,3-BDO-producing S. cerevisiae strain.
中文翻译:
通过体内DNA组装和可复制的CRISPR-Cas9介导的δ整合,在酿酒酵母中进行2,3-丁二醇生物合成途径的高拷贝基因组整合。
CRISPR Cas9系统正在成为一个新兴的基因组编辑平台,已被广泛用于酿酒酵母的多重基因组工程。在这项研究中,我们开发了一种新型的复制和整合CRISPR Cas9基因组编辑平台,用于酿酒酵母中大型DNA构建体的体内组装,复制和高拷贝基因组整合。它利用了酿酒酵母中自主复制序列,体内DNA组装,CRISPR Cas9和delta整合的优势。增强的绿色荧光蛋白被用作标记,以确认大型DNA构建体的体内组装和基因组整合。基于该平台,通过多达25个拷贝的2,3-BDO生物合成途径的基因组整合,快速构建了高效的2,3-BDO生产酵母菌株。通过使用包含供体DNA的2μs复制CRISPR Cas9质粒对ADH1,PDC1,PDC5和MTH1进行多重破坏,可以进行进一步的菌株工程设计。结果,与最初的工程酵母相比,其2,3-BDO滴度提高了3.9倍,最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在补料分批中产生了50.5 g / L的2,3-BDO。发酵而无需菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在分批补料发酵中产生了5 g / L 2,3-BDO,而没有菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在分批补料发酵中产生了5 g / L 2,3-BDO,而没有菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。
更新日期:2020-01-29
中文翻译:
通过体内DNA组装和可复制的CRISPR-Cas9介导的δ整合,在酿酒酵母中进行2,3-丁二醇生物合成途径的高拷贝基因组整合。
CRISPR Cas9系统正在成为一个新兴的基因组编辑平台,已被广泛用于酿酒酵母的多重基因组工程。在这项研究中,我们开发了一种新型的复制和整合CRISPR Cas9基因组编辑平台,用于酿酒酵母中大型DNA构建体的体内组装,复制和高拷贝基因组整合。它利用了酿酒酵母中自主复制序列,体内DNA组装,CRISPR Cas9和delta整合的优势。增强的绿色荧光蛋白被用作标记,以确认大型DNA构建体的体内组装和基因组整合。基于该平台,通过多达25个拷贝的2,3-BDO生物合成途径的基因组整合,快速构建了高效的2,3-BDO生产酵母菌株。通过使用包含供体DNA的2μs复制CRISPR Cas9质粒对ADH1,PDC1,PDC5和MTH1进行多重破坏,可以进行进一步的菌株工程设计。结果,与最初的工程酵母相比,其2,3-BDO滴度提高了3.9倍,最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在补料分批中产生了50.5 g / L的2,3-BDO。发酵而无需菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在分批补料发酵中产生了5 g / L 2,3-BDO,而没有菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。最终的工程酵母菌株36aS5-CFBDO在分批补料发酵中产生了5 g / L 2,3-BDO,而没有菌株进化和工艺优化。这项研究表明,新的复制和整合的CRISPR Cas9基因组编辑平台有望产生高效的产生2,3-BDO的酿酒酵母菌株。