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Systematic optimization of square-wave electroporation conditions for bovine primary fibroblasts.
BMC Molecular and Cell Biology ( IF 2.8 ) Pub Date : 2020-02-28 , DOI: 10.1186/s12860-020-00254-5 Iqbal Hyder 1, 2 , Shahin Eghbalsaied 1, 3 , Wilfried A Kues 1
BMC Molecular and Cell Biology ( IF 2.8 ) Pub Date : 2020-02-28 , DOI: 10.1186/s12860-020-00254-5 Iqbal Hyder 1, 2 , Shahin Eghbalsaied 1, 3 , Wilfried A Kues 1
Affiliation
BACKGROUND
Gene transfer by electroporation is an established method for the non-viral mediated transfection of mammalian cells. Primary cells pose a particular challenge for electroporation-mediated gene transfer, since they are more vulnerable than immortalized cells, and have a limited proliferative capacity. Improving the gene transfer by using square wave electroporation in difficult to transfect cells, like bovine fetal fibroblasts, is a prerequisite for transgenic and further downstream experiments.
RESULTS
Here, bovine fetal fibroblasts were used for square-wave electroporation experiments in which the following parameters were systematically tested: electroporation buffer, electroporation temperature, pulse voltage, pulse duration, pulse number, cuvette type and plasmid DNA amount. For the experiments a commercially available square-wave generator was applied. Post electroporation, the bovine fetal fibroblasts were observed after 24 h for viability and reporter expression. The best results were obtained with a single 10 millisecond square-wave pulse of 400 V using 10 μg supercoiled plasmid DNA and 0.3 × 106 cells in 100 μl of Opti-MEM medium in 4 mm cuvettes. Importantly, the electroporation at room temperature was considerably better than with pre-cooled conditions.
CONCLUSIONS
The optimized electroporation conditions will be relevant for gene transfer experiments in bovine fetal fibroblasts to obtain genetically engineered donor cells for somatic cell nuclear transfer and for reprogramming experiments in this species.
中文翻译:
牛初级成纤维细胞方波电穿孔条件的系统优化。
背景技术通过电穿孔进行的基因转移是用于哺乳动物细胞的非病毒介导的转染的既定方法。原代细胞对电穿孔介导的基因转移构成特殊挑战,因为它们比永生化细胞更脆弱,并且增殖能力有限。通过在难以转染的细胞(如牛胎儿成纤维细胞)中使用方波电穿孔来改善基因转移,是转基因和进一步下游实验的先决条件。结果在这里,牛胎儿成纤维细胞被用于方波电穿孔实验,其中系统地测试了以下参数:电穿孔缓冲液,电穿孔温度,脉冲电压,脉冲持续时间,脉冲数,比色皿类型和质粒DNA量。为了进行实验,使用了市售的方波发生器。电穿孔后,在24小时后观察到牛胎儿成纤维细胞的活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。24小时后观察牛胎儿成纤维细胞的存活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。24小时后观察牛胎儿成纤维细胞的存活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。在4毫米比色皿中的100μlOpti-MEM培养基中3×106细胞。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。在4毫米比色皿中的100μlOpti-MEM培养基中3×106细胞。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。
更新日期:2020-04-22
中文翻译:
牛初级成纤维细胞方波电穿孔条件的系统优化。
背景技术通过电穿孔进行的基因转移是用于哺乳动物细胞的非病毒介导的转染的既定方法。原代细胞对电穿孔介导的基因转移构成特殊挑战,因为它们比永生化细胞更脆弱,并且增殖能力有限。通过在难以转染的细胞(如牛胎儿成纤维细胞)中使用方波电穿孔来改善基因转移,是转基因和进一步下游实验的先决条件。结果在这里,牛胎儿成纤维细胞被用于方波电穿孔实验,其中系统地测试了以下参数:电穿孔缓冲液,电穿孔温度,脉冲电压,脉冲持续时间,脉冲数,比色皿类型和质粒DNA量。为了进行实验,使用了市售的方波发生器。电穿孔后,在24小时后观察到牛胎儿成纤维细胞的活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。24小时后观察牛胎儿成纤维细胞的存活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。24小时后观察牛胎儿成纤维细胞的存活力和报告基因表达。使用10μg超螺旋质粒DNA和100μl4 mm比色皿中的Opti-MEM培养基中的0.3×106细胞,用400 V的10毫秒方波脉冲获得最佳结果。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。在4毫米比色皿中的100μlOpti-MEM培养基中3×106细胞。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。在4毫米比色皿中的100μlOpti-MEM培养基中3×106细胞。重要的是,室温下的电穿孔比预冷条件下要好得多。结论优化的电穿孔条件将与牛胎儿成纤维细胞中的基因转移实验有关,以获取基因工程的供体细胞进行体细胞核转移以及对该物种进行重编程实验。