Background CRISPR-Cas9 has been developed as a therapeutic agent for various infectious and genetic diseases. In many clinically relevant applications, constitutively active CRISPR-Cas9 is delivered into human cells without a temporal control system. Excessive and prolonged expression of CRISPR-Cas9 can lead to elevated off-target cleavage. The need for modulating CRISPR-Cas9 activity over time and dose has created the demand of developing CRISPR-Cas off switches. Protein and small molecule-based CRISPR-Cas inhibitors have been reported in previous studies. Results We report the discovery of Cas9-inhibiting peptides from inoviridae bacteriophages. These peptides, derived from the periplasmic domain of phage major coat protein G8P (G8P PD ), can inhibit the in vitro activity of Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) proteins in an allosteric manner. Importantly, the inhibitory activity of G8P PD on SpCas9 is dependent on the order of guide RNA addition. Ectopic expression of full-length G8P (G8P FL ) or G8P PD in human cells can inactivate the genome-editing activity of SpyCas9 with minimum alterations of the mutation patterns. Furthermore, unlike the anti-CRISPR protein AcrII4A that completely abolishes the cellular activity of CRISPR-Cas9, G8P co-transfection can reduce the off-target activity of co-transfected SpCas9 while retaining its on-target activity. Conclusion G8Ps discovered in the current study represent the first anti-CRISPR peptides that can allosterically inactivate CRISPR-Cas9. This finding may provide insights into developing next-generation CRISPR-Cas inhibitors for precision genome engineering.

中文翻译：

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噬菌体衍生肽对 CRISPR-Cas9 的变构抑制

背景 CRISPR-Cas9 已被开发为各种传染病和遗传疾病的治疗剂。在许多临床相关应用中，组成型活性 CRISPR-Cas9 在没有时间控制系统的情况下被输送到人体细胞中。CRISPR-Cas9 的过度和延长表达会导致脱靶裂解升高。随着时间和剂量调节 CRISPR-Cas9 活性的需求产生了开发 CRISPR-Cas 关闭开关的需求。之前的研究中已经报道了基于蛋白质和小分子的 CRISPR-Cas 抑制剂。结果 我们报告了从病毒科噬菌体中发现的 Cas9 抑制肽。这些肽来源于噬菌体主要外壳蛋白 G8P (G8P PD ) 的周质结构域，可以以变构方式抑制化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白的体外活性。重要的是，G8P PD 对 SpCas9 的抑制活性取决于引导 RNA 添加的顺序。人类细胞中全长 G8P (G8P FL ) 或 G8P PD 的异位表达可以使 SpyCas9 的基因组编辑活性失活，并且突变模式的改变最小。此外，与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。G8P PD 对 SpCas9 的抑制活性取决于引导 RNA 添加的顺序。人类细胞中全长 G8P (G8P FL ) 或 G8P PD 的异位表达可以使 SpyCas9 的基因组编辑活性失活，并且突变模式的改变最小。此外，与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。G8P PD 对 SpCas9 的抑制活性取决于引导 RNA 添加的顺序。人类细胞中全长 G8P (G8P FL ) 或 G8P PD 的异位表达可以使 SpyCas9 的基因组编辑活性失活，并且突变模式的改变最小。此外，与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。人类细胞中全长 G8P (G8P FL ) 或 G8P PD 的异位表达可以使 SpyCas9 的基因组编辑活性失活，并且突变模式的改变最小。此外，与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。人类细胞中全长 G8P (G8P FL ) 或 G8P PD 的异位表达可以使 SpyCas9 的基因组编辑活性失活，并且突变模式的改变最小。此外，与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。与完全消除 CRISPR-Cas9 细胞活性的抗 CRISPR 蛋白 AcrII4A 不同，G8P 共转染可以降低共转染的 SpCas9 的脱靶活性，同时保留其在靶活性。结论 在当前研究中发现的 G8Ps 代表了第一个可以变构灭活 CRISPR-Cas9 的抗 CRISPR 肽。这一发现可能为开发用于精确基因组工程的下一代 CRISPR-Cas 抑制剂提供见解。