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Nucleolar localization of the Notch4 intracellular domain underpins its regulation of the cellular response to genotoxic stressors.
Cell Death Discovery ( IF 7 ) Pub Date : 2020-02-18 , DOI: 10.1038/s41420-020-0242-y Neetu Saini 1, 2 , Apurva Sarin 1
Cell Death Discovery ( IF 7 ) Pub Date : 2020-02-18 , DOI: 10.1038/s41420-020-0242-y Neetu Saini 1, 2 , Apurva Sarin 1
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Cell survival is one of the many cellular processes regulated by Notch family of proteins. A comparison of human breast cancer cell lines, which differ in the levels of endogenous Notch4, implicated the protein in regulating susceptibility to apoptosis triggered by genomic damage. In agreement with this observation, increased susceptibility to genotoxic damage was observed following siRNA ablations of Notch4 in two breast cancer cell lines. Further, overexpressing Notch4 intracellular domain (NIC4) tagged to GFP (NIC4-GFP), protected cells from apoptosis triggered by genotoxic drugs. In cells immune-stained for endogenous Notch4, protein was detected in the nucleolus and nucleoplasm, which was also confirmed by the co-localization of NIC4-GFP with RFP-tagged nucleolar proteins in breast cancer cells or the unrelated HEK cell line. Linking functional outcomes to nucleolar localization, NIC4-GFP protection from apoptosis, required the nucleolar proteins Nucleolin and Fibrillarin. Consistently, immunoprecipitation analysis revealed associations between nucleolar proteins-Nucleolin and Nucleophosmin-and Notch4. Microscopy-based biophysical analysis of live cells showed that nucleolar and nucleoplasmic pools of NIC4-GFP are mobile, with some sequestration of nucleolar NIC4-GFP pools. A nucleolar excluded form, NIC4_3RA-GFP, generated by site-directed mutagenesis of the nucleolar localization sequence in NIC4, could not protect from apoptosis triggered by genotoxic stressors. However, transcriptional activity or protection from apoptosis triggered by endoplasmic stress was comparable in cells expressing NIC4_3RA-GFP or NIC4-GFP. Together, the data show that nucleolar localization of NIC4 is critical for the regulation of genomic damage and may be uncoupled from its activities in the nucleoplasm. This study identifies intrinsic features of NIC4 that regulate signaling outcomes activated by the receptor by controlling its spatial localization.
中文翻译:
Notch4 胞内结构域的核仁定位支持其对基因毒性应激源的细胞反应的调节。
细胞存活是 Notch 蛋白家族调节的众多细胞过程之一。对内源性 Notch4 水平不同的人类乳腺癌细胞系进行比较,发现该蛋白参与调节基因组损伤引发的细胞凋亡的易感性。与这一观察结果一致的是,在两种乳腺癌细胞系中用 siRNA 消除 Notch4 后观察到对基因毒性损伤的敏感性增加。此外,过度表达标记有 GFP 的 Notch4 胞内结构域 (NIC4) (NIC4-GFP) 可保护细胞免受基因毒性药物引发的细胞凋亡。在对内源性 Notch4 进行免疫染色的细胞中,在核仁和核质中检测到蛋白质,这也通过 NIC4-GFP 与乳腺癌细胞或无关 HEK 细胞系中 RFP 标记的核仁蛋白质的共定位得到证实。将功能结果与核仁定位联系起来,NIC4-GFP 防止细胞凋亡,需要核仁蛋白 Nucleolin 和 Fibrillarin。免疫沉淀分析一致地揭示了核仁蛋白(核仁蛋白和核磷蛋白)与 Notch4 之间的关联。基于显微镜的活细胞生物物理分析表明,NIC4-GFP 的核仁和核质库是可移动的,核仁 NIC4-GFP 库有一定程度的隔离。核仁排除形式 NIC4_3RA-GFP,是通过 NIC4 核仁定位序列的定点诱变产生的,不能防止基因毒性应激物引发的细胞凋亡。然而,在表达 NIC4_3RA-GFP 或 NIC4-GFP 的细胞中,转录活性或免受内质应激触发的细胞凋亡的保护是相当的。总之,数据表明 NIC4 的核仁定位对于基因组损伤的调节至关重要,并且可能与其在核质中的活性脱钩。这项研究确定了 NIC4 的内在特征,这些特征通过控制其空间定位来调节受体激活的信号结果。
更新日期:2020-02-18
中文翻译:
Notch4 胞内结构域的核仁定位支持其对基因毒性应激源的细胞反应的调节。
细胞存活是 Notch 蛋白家族调节的众多细胞过程之一。对内源性 Notch4 水平不同的人类乳腺癌细胞系进行比较,发现该蛋白参与调节基因组损伤引发的细胞凋亡的易感性。与这一观察结果一致的是,在两种乳腺癌细胞系中用 siRNA 消除 Notch4 后观察到对基因毒性损伤的敏感性增加。此外,过度表达标记有 GFP 的 Notch4 胞内结构域 (NIC4) (NIC4-GFP) 可保护细胞免受基因毒性药物引发的细胞凋亡。在对内源性 Notch4 进行免疫染色的细胞中,在核仁和核质中检测到蛋白质,这也通过 NIC4-GFP 与乳腺癌细胞或无关 HEK 细胞系中 RFP 标记的核仁蛋白质的共定位得到证实。将功能结果与核仁定位联系起来,NIC4-GFP 防止细胞凋亡,需要核仁蛋白 Nucleolin 和 Fibrillarin。免疫沉淀分析一致地揭示了核仁蛋白(核仁蛋白和核磷蛋白)与 Notch4 之间的关联。基于显微镜的活细胞生物物理分析表明,NIC4-GFP 的核仁和核质库是可移动的,核仁 NIC4-GFP 库有一定程度的隔离。核仁排除形式 NIC4_3RA-GFP,是通过 NIC4 核仁定位序列的定点诱变产生的,不能防止基因毒性应激物引发的细胞凋亡。然而,在表达 NIC4_3RA-GFP 或 NIC4-GFP 的细胞中,转录活性或免受内质应激触发的细胞凋亡的保护是相当的。总之,数据表明 NIC4 的核仁定位对于基因组损伤的调节至关重要,并且可能与其在核质中的活性脱钩。这项研究确定了 NIC4 的内在特征,这些特征通过控制其空间定位来调节受体激活的信号结果。