Lack of specific markers for innate lymphoid cells (ILCs) limit our knowledge on their spatial organization in situ. We compared two quadruple-color staining protocols for detection of the three principal human ILC subsets in formalin-fixed paraffin-embedded specimens. ILC subset-associated archetypical transcription factors (TFs) T-bet, GATA3, and RORγt were used as positive identifiers in combination with lymphoid lineage markers to exclude non-ILCs. One method ("virtual quadruple staining") comprised of iterative single stainings on the same section performing digital scanning and subsequent immunoglobulin and chromogen stripping after each staining round. The second technique ("true-color quadruple staining") comprised sequential double stainings with permanent colors. Both protocols appeared suitable for accurate detection of each ILC subset, and as added result, concomitant visualization of their T cell subset counterpart. Only true-color quadruple staining enabled simultaneous detection of all three ILC subsets within one section. Furthermore, we found that type 3 and type 1 ILCs (ILC1s) represent the major subsets in colon and that part of the ILC1s typically colocalizes with blood vessels. Our data highlight the utility of TFs combined with lineage markers for the identification of ILC subsets and proposed workflow opens the way to gain deeper insight of their anatomical distribution.

中文翻译：

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比较两种不同的免疫组织化学四重染色方法来鉴定福尔马林固定石蜡包埋的人类组织中的先天淋巴样细胞。

缺乏固有淋巴样细胞（ILCs）的特异性标记，限制了我们对其原位空间组织的了解。我们比较了两种四色染色方案，用于检测福尔马林固定石蜡包埋的标本中的三个主要人类ILC亚型。ILC与子集相关的原型转录因子（TFs）T-bet，GATA3和RORγt与淋巴谱系标记一起用作阳性识别符，以排除非ILC。一种方法（“虚拟四重染色”）由在同一部分进行的迭代单次染色组成，在每次染色后进行数字扫描，随后进行免疫球蛋白和色原剥离。第二种技术（“真彩色四色染色”）包括具有永久色的连续双色染色。两种协议似乎都适合准确检测每个ILC子集，并且作为附加结果，还可以同时可视化其T细胞子集对应物。只有真彩色四色染色才能在一个区域内同时检测所有三个ILC子集。此外，我们发现3型和1型ILC（ILC1s）代表结肠中的主要子集，并且一部分ILC1s通常与血管共定位。我们的数据强调了TF与谱系标记物结合使用来识别ILC子集的实用性，并且所提出的工作流程为深入了解其解剖分布开辟了道路。我们发现3型和1型ILC（ILC1s）代表了结肠中的主要子集，并且部分ILC1s通常与血管共定位。我们的数据强调了TF与谱系标记物结合使用来识别ILC子集的实用性，并且所提出的工作流程为深入了解其解剖分布开辟了道路。我们发现3型和1型ILC（ILC1s）代表了结肠中的主要子集，并且部分ILC1s通常与血管共定位。我们的数据强调了TF与谱系标记物结合使用来识别ILC子集的实用性，并且所提出的工作流程为深入了解其解剖分布开辟了道路。