CRISPR-Cas9-mediated gene interference (CRISPRi) and activation (CRISPRa) approaches hold promise for functional gene studies and genome-wide screens in human pluripotent stem cells (hPSCs). However, in contrast to CRISPR-Cas9 nuclease approaches, the efficiency of CRISPRi/a depends on continued expression of the dead Cas9 (dCas9) effector and guide RNA (gRNA), which can vary substantially depending on transgene design and delivery. Here, we design and generate new fluorescently labeled piggyBac (PB) vectors to deliver uniform and sustained expression of multiplexed gRNAs. In addition, we generate hPSC lines harboring AAVS1-integrated, inducible and fluorescent dCas9-KRAB and dCas9-VPR transgenes to allow for accurate quantification and tracking of cells that express both the dCas9 effectors and gRNAs. We then employ these systems to target the TCF4 gene in hPSCs and assess expression levels of the dCas9 effectors, individual gRNAs and targeted gene. We also assess the performance of our PB system for single gRNA delivery, confirming its utility for library format applications. Collectively, our results provide proof-of-principle application of a stable, multiplexed PB gRNA delivery system that can be widely exploited to further enable genome engineering studies in hPSCs. Paired with diverse CRISPR tools including our dual fluorescence CRISPRi/a cell lines, this system can facilitate functional dissection of individual genes and pathways as well as larger-scale screens for studies of development and disease.

中文翻译：

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多重gRNApiggyBac转座子系统有助于在人多能干细胞中有效诱导CRISPRi和CRISPRa。

CRISPR-Cas9介导的基因干扰（CRISPRi）和激活（CRISPRa）方法为人类多能干细胞（hPSC）中的功能基因研究和全基因组筛选提供了希望。然而，与CRISPR-Cas9核酸酶方法相比，CRISPRi / a的效率取决于死亡的Cas9（dCas9）效应子和指导RNA（gRNA）的持续表达，其可根据转基因设计和递送而有很大差异。在这里，我们设计并生成新的荧光标记的piggyBac（PB）载体，以提供均匀且持续表达的多重gRNA。此外，我们生成了带有AAVS1整合型，诱导型和荧光dCas9-KRAB和dCas9-VPR转基因的hPSC品系，可对表达dCas9效应子和gRNA的细胞进行准确的定量和跟踪。然后，我们采用这些系统来靶向hPSC中的TCF4基因，并评估dCas9效应子，单个gRNA和靶向基因的表达水平。我们还评估了用于单gRNA递送的PB系统的性能，确认了其在文库格式应用中的效用。总的来说，我们的结果为稳定，多重的PB gRNA递送系统的原理应用提供了证明，该系统可广泛用于进一步实现hPSC中的基因组工程研究。该系统与包括我们的双荧光CRISPRi / a细胞系在内的各种CRISPR工具搭配使用，可以促进单个基因和途径的功能解剖，以及用于发育和疾病研究的大规模筛选。我们还评估了单gRNA递送的PB系统的性能，从而证实了其在文库格式应用中的效用。总的来说，我们的结果为稳定，多重的PB gRNA递送系统的原理应用提供了证明，该系统可广泛用于进一步实现hPSC中的基因组工程研究。该系统与包括我们的双荧光CRISPRi / a细胞系在内的各种CRISPR工具搭配使用，可以促进单个基因和途径的功能解剖，以及用于发育和疾病研究的大规模筛选。我们还评估了单gRNA递送的PB系统的性能，从而证实了其在文库格式应用中的效用。总的来说，我们的结果为稳定，多重的PB gRNA递送系统的原理应用提供了证明，该系统可广泛用于进一步实现hPSC中的基因组工程研究。该系统与包括我们的双荧光CRISPRi / a细胞系在内的各种CRISPR工具搭配使用，可以促进单个基因和途径的功能解剖，以及用于发育和疾病研究的大规模筛选。多重PB gRNA递送系统，可广泛用于进一步实现hPSC中的基因组工程研究。该系统与包括我们的双荧光CRISPRi / a细胞系在内的各种CRISPR工具搭配使用，可以促进单个基因和途径的功能解剖，以及用于发育和疾病研究的大规模筛选。多重PB gRNA递送系统，可广泛用于进一步实现hPSC中的基因组工程研究。该系统与包括我们的双荧光CRISPRi / a细胞系在内的各种CRISPR工具搭配使用，可以促进单个基因和途径的功能解剖，以及用于发育和疾病研究的大规模筛选。