Alpha-1-antitrypsin (A1AT) is an abundant serum inhibitor of serine proteases. A1AT deficiency is a common genetic disorder which is currently treated with augmentation therapies. These treatments involve weekly injections of patients with purified plasma-derived A1AT. Such therapies can be extremely expensive and rely on plasma donors. Hence, large-scale production of recombinant A1AT (rA1AT) could greatly benefit these patients, as it could decrease the cost of treatments, reduce biosafety concerns and ensure quantitative and qualitative controls of the protein. In this report, we sought to produce α2,6-sialylated rA1AT with our cumate-inducible stable CHO pool expression system. Our different CHO pools could reach volumetric productivities of 1,2 g/L. The human α2,6-sialyltransferase was stably expressed in these cells in order to mimic elevated α2,6-sialylation levels of native A1AT protein. Sialylation of the recombinant protein was stable over the duration of the fed-batch production phase and was higher in a pool where cells were sorted and enriched by FACS based on cell-surface α2,6-sialylation. Addition of ManNAc to the cell culture media during production enhanced both α2,3 and α2,6 A1AT sialylation levels whereas addition of 2F-peracetylfucose potently inhibited fucosylation of the protein. Finally, we demonstrated that rA1AT proteins exhibited human neutrophil elastase inhibitory activities similar to the commercial human plasma-derived A1AT.

中文翻译：

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在CHO细胞中产生α2，6-唾液酸化和非岩藻糖基化的重组α-1-抗胰蛋白酶。

Alpha-1-antitrypsin（A1AT）是一种丰富的丝氨酸蛋白酶血清抑制剂。A1AT缺乏症是一种常见的遗传性疾病，目前正在用增强疗法进行治疗。这些治疗包括每周注射纯化的血浆来源的A1AT患者。这样的疗法可能非常昂贵并且依赖于血浆供体。因此，大规模生产重组A1AT（rA1AT）可以极大地使这些患者受益，因为它可以降低治疗费用，降低生物安全性并确保对该蛋白质进行定量和定性控制。在本报告中，我们试图用我们的枯草酸盐诱导的稳定CHO池表达系统产生α2，6-唾液酸化的rA1AT。我们不同的CHO库可以达到1,2 g / L的容积生产率。人类α2 6-唾液酸转移酶在这些细胞中稳定表达，以模拟天然A1AT蛋白的升高的α2,6-唾液酸化水平。重组蛋白的唾液酸化在补料分批生产阶段的整个过程中是稳定的，并且在基于细胞表面α2,6-唾液酸化的FACS分选和富集细胞的池中更高。在生产过程中向细胞培养基中添加ManNAc可以增强α2,3和α2,6A1AT唾液酸化水平，而2F-过乙酰基岩藻糖的添加则有效地抑制了蛋白质的岩藻糖基化。最后，我们证明了rA1AT蛋白具有与人血浆衍生的A1AT类似的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制活性。重组蛋白的唾液酸化在补料分批生产阶段的整个过程中是稳定的，并且在基于细胞表面α2,6-唾液酸化的FACS分选和富集细胞的池中更高。在生产过程中向细胞培养基中添加ManNAc可以增强α2,3和α2,6A1AT唾液酸化水平，而2F-过乙酰基岩藻糖的添加则可以有效地抑制蛋白质的岩藻糖基化。最后，我们证明了rA1AT蛋白具有与人血浆衍生的A1AT类似的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制活性。重组蛋白的唾液酸化在补料分批生产阶段的整个过程中是稳定的，并且在基于细胞表面α2,6-唾液酸化的FACS分选和富集细胞的池中更高。在生产过程中向细胞培养基中添加ManNAc可以增强α2,3和α2,6A1AT唾液酸化水平，而2F-过乙酰基岩藻糖的添加则可以有效地抑制蛋白质的岩藻糖基化。最后，我们证明了rA1AT蛋白具有与人血浆衍生的A1AT类似的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制活性。6 A1AT唾液酸化水平，而添加2F-过乙酰基岩藻糖则有效地抑制了蛋白质的岩藻糖基化。最后，我们证明了rA1AT蛋白具有与人血浆衍生的A1AT类似的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制活性。6 A1AT唾液酸化水平，而添加2F-过乙酰基岩藻糖则有效地抑制了蛋白质的岩藻糖基化。最后，我们证明了rA1AT蛋白具有与人血浆衍生的A1AT类似的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制活性。