Gene-modified animals, including pigs, can be generated efficiently by introducing CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) into zygotes. However, in many cases, these zygotes tend to become mosaic mutants with various different mutant cell types, making it difficult to analyze the phenotype of gene-modified founder animals. To reduce the mosaic mutations, we introduced three-prime repair exonuclease 2 (Trex2), an exonuclease that improves gene editing efficiency, into porcine zygotes along with CRISPR/Cas9 via electroporation. Although the rate of porcine blastocyst formation decreased due to electroporation (25.9 ± 4.6% vs. 41.2 ± 2.0%), co-delivery of murine Trex2 (mTrex2) mRNA with CRISPR/Cas9 did not affect it any further (25.9 ± 4.6% vs. 31.0 ± 4.6%). In addition, there was no significant difference in the diameter of blastocysts carrying CRISPR/Cas9 (164.7 ± 10.2 μm), and those with CRISPR/Cas9 + mTrex2 (151.9 ± 5.1 μm) as compared to those from the control group (178.9 ± 9.0 μm). These results revealed that mTrex2 did not affect the development of pre-implantation embryo. We also found bi-allelic, as well as mono-allelic, non-mosaic homozygous mutations in the blastocysts. Most importantly, co-delivery of mTrex2 mRNA with CRISPR/Cas9 increased non-mosaic mutant blastocysts (29.3 ± 4.5%) and reduced mosaic mutant blastocysts (70.7 ± 4.5%) as compared to CRISPR/Cas9 alone (5.6 ± 6.4% and 92.6 ± 8.6%, respectively). These data suggest that the co-delivery of CRISPR/Cas9 and mTrex2 is a useful method to suppress mosaic mutation.

中文翻译：

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通过电穿孔将 CRISPR 相关蛋白 9 和三引物修复外切核酸酶 2 共同递送到猪受精卵中抑制镶嵌突变

通过将 CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 引入受精卵，可以有效地产生基因修饰的动物，包括猪。然而，在许多情况下，这些受精卵往往会变成具有各种不同突变细胞类型的镶嵌突变体，这使得分析基因修饰的创始动物的表型变得困难。为了减少嵌合突变，我们通过电穿孔将三引物修复外切核酸酶 2 (Trex2)（一种提高基因编辑效率的外切核酸酶）与 CRISPR/Cas9 一起引入猪受精卵。尽管猪囊胚形成率因电穿孔而降低（25.9 ± 4.6% 与 41.2 ± 2.0%），但小鼠 Trex2 (mTrex2) mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送并未对其产生任何进一步影响（25.9 ± 4.6% 与31.0 ± 4.6%）。此外，携带CRISPR/Cas9的囊胚直径（164.7±10.2μm）和携带CRISPR/Cas9+mTrex2的囊胚直径（151.9±5.1μm）与对照组（178.9±9.0μm）相比没有显着差异。这些结果表明mTrex2不影响植入前胚胎的发育。我们还在胚泡中发现了双等位基因以及单等位基因、非镶嵌纯合突变。最重要的是，与单独使用 CRISPR/Cas9（5.6 ± 6.4% 和 92.6）相比，mTrex2 mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送增加了非镶嵌突变囊胚（29.3 ± 4.5%）并减少了镶嵌突变囊胚（70.7 ± 4.5%）。 ± 8.6%，分别）。这些数据表明 CRISPR/Cas9 和 mTrex2 的共同递送是抑制镶嵌突变的有用方法。1 μm) 与对照组 (178.9 ± 9.0 μm) 相比。这些结果表明mTrex2不影响植入前胚胎的发育。我们还在胚泡中发现了双等位基因以及单等位基因、非镶嵌纯合突变。最重要的是，与单独使用 CRISPR/Cas9（5.6 ± 6.4% 和 92.6）相比，mTrex2 mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送增加了非镶嵌突变囊胚（29.3 ± 4.5%）并减少了镶嵌突变囊胚（70.7 ± 4.5%）。 ± 8.6%，分别）。这些数据表明 CRISPR/Cas9 和 mTrex2 的共同递送是抑制镶嵌突变的有用方法。1 μm) 与对照组 (178.9 ± 9.0 μm) 相比。这些结果表明mTrex2不影响植入前胚胎的发育。我们还在胚泡中发现了双等位基因以及单等位基因、非镶嵌纯合突变。最重要的是，与单独使用 CRISPR/Cas9（5.6 ± 6.4% 和 92.6）相比，mTrex2 mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送增加了非镶嵌突变囊胚（29.3 ± 4.5%）并减少了镶嵌突变囊胚（70.7 ± 4.5%）。 ± 8.6%，分别）。这些数据表明 CRISPR/Cas9 和 mTrex2 的共同递送是抑制镶嵌突变的有用方法。胚泡中的非镶嵌纯合突变。最重要的是，与单独使用 CRISPR/Cas9（5.6 ± 6.4% 和 92.6）相比，mTrex2 mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送增加了非镶嵌突变囊胚（29.3 ± 4.5%）并减少了镶嵌突变囊胚（70.7 ± 4.5%）。 ± 8.6%，分别）。这些数据表明 CRISPR/Cas9 和 mTrex2 的共同递送是抑制镶嵌突变的有用方法。胚泡中的非镶嵌纯合突变。最重要的是，与单独使用 CRISPR/Cas9（5.6 ± 6.4% 和 92.6）相比，mTrex2 mRNA 与 CRISPR/Cas9 的共同递送增加了非镶嵌突变囊胚（29.3 ± 4.5%）并减少了镶嵌突变囊胚（70.7 ± 4.5%）。 ± 8.6%，分别）。这些数据表明 CRISPR/Cas9 和 mTrex2 的共同递送是抑制镶嵌突变的有用方法。