Advancements in chromatographic separation are critical to in-depth top-down proteomics of complex intact protein samples. Reversed-phase liquid chromatography is the most prevalent technique for top-down proteomics. However, in cases of high complexities and large dynamic ranges, 1D-RPLC may not provide sufficient coverage of the proteome. To address these challenges, orthogonal separation techniques are often combined to improve the coverage and the dynamic range of detection. In this study, a "salt-free" high-pH RPLC was evaluated as an orthogonal dimension of separation to conventional low-pH RPLC with top-down MS. The RPLC separations with low-pH conditions (pH=2) and high-pH conditions (pH=10) were compared to confirm the good orthogonality between high-pH and low-pH RPLC's. The offline 2D RPLC-RPLC-MS/MS analyses of intact E. coli samples were evaluated for the improvement of intact protein identifications as well as intact proteoform characterizations. Compared to the 163 proteins and 328 proteoforms identified using a 1D RPLC-MS approach, 365 proteins and 886 proteoforms were identified using the 2D RPLC-RPLC top-down MS approach. Our results demonstrate that the 2D RPLC-RPLC top-down approach holds great potential for in-depth top-down proteomics studies by utilizing the high resolving power of RPLC separations and by using mass spectrometry compatible buffers for easy sample handling for online MS analysis.

中文翻译：

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使用高 pH 和低 pH 反相液相色谱进行自上而下蛋白质组学的二维分离

色谱分离的进步对于复杂完整蛋白质样品的深入蛋白质组学至关重要。反相液相色谱是自上而下蛋白质组学最流行的技术。然而，在高复杂性和大动态范围的情况下，1D-RPLC 可能无法提供足够的蛋白质组覆盖范围。为了应对这些挑战，通常结合正交分离技术来提高检测的覆盖范围和动态范围。在本研究中，“无盐”高 pH RPLC 被评估为与采用自上而下 MS 的传统低 pH RPLC 分离的正交维度。比较了在低 pH 条件 (pH=2) 和高 pH 条件 (pH=10) 下的 RPLC 分离，以确认高 pH 和低 pH RPLC 之间的良好正交性。完整大肠杆菌的离线 2D RPLC-RPLC-MS/MS 分析。对大肠杆菌样品进行了评估，以改进完整蛋白质的鉴定以及完整的蛋白质组特征。与使用 1D RPLC-MS 方法鉴定的 163 种蛋白质和 328 种蛋白质型相比，使用 2D RPLC-RPLC 自上而下的 MS 方法鉴定了 365 种蛋白质和 886 种蛋白质型。我们的结果表明，二维 RPLC-RPLC 自上而下的方法通过利用 RPLC 分离的高分辨率和使用质谱兼容的缓冲液来轻松处理在线 MS 分析的样品，在深入的自上而下蛋白质组学研究方面具有巨大潜力。使用 2D RPLC-RPLC 自上而下 MS 方法鉴定了 365 种蛋白质和 886 种蛋白质型。我们的结果表明，二维 RPLC-RPLC 自上而下的方法通过利用 RPLC 分离的高分辨率和使用质谱兼容的缓冲液来轻松处理在线 MS 分析的样品，在深入的自上而下蛋白质组学研究方面具有巨大潜力。使用 2D RPLC-RPLC 自上而下 MS 方法鉴定了 365 种蛋白质和 886 种蛋白质型。我们的结果表明，二维 RPLC-RPLC 自上而下的方法通过利用 RPLC 分离的高分辨率和使用质谱兼容的缓冲液来轻松处理在线 MS 分析的样品，在深入的自上而下蛋白质组学研究方面具有巨大潜力。