ABSTRACT Paxillin is a focal adhesion adaptor protein, heavily phosphorylated at multiple tyrosine residues, as well as at serine 273 (S273), and is known to be critical for cytoskeleton rearrangement and cell migration. We previously found that paxillin plays a regulatory role in IL-3-dependent survival of Ba/F3 cells, a mouse pro-B cell line. In this study, by using overexpressed His6 tagged-paxillin as a bait, we found that DDX42, a DEAD-box RNA helicase, interacted with paxillin, inhibited apoptosis, and promoted polarization of Ba/F3 cells. His6 tagged-paxillin was stably overexpressed in Ba/F3 cells, pulled-down from cell lysates with Ni+-NTA beads, and analyzed by one-dimensional SDS-PAGE followed by LC–MS. We found that DDX42 co-precipitated with paxillin, as demonstrated by western blotting analysis of His6 tagged-paxillin precipitates with anti-DDX42 antibodies and His6 tagged-DDX42 precipitates with anti-paxillin antibodies. In addition, we observed a preferential interaction of DDX42 with the paxillin mutant, S273A, compared to the S273D mutant. Furthermore, DDX42 overexpression in Ba/F3 cells delayed the apoptosis induced by IL-3 deprivation and promoted restoration of the elongated shape in Ba/F3 cells induced by IL-3 re-supply after a 6 h-deprivation. These results suggested that DDX42 interacts with paxillin and participates in IL-3-dependent cell survival, as well as in the cytoskeletal rearrangements underlying polarization of Ba/F3 cells.

中文翻译：

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ATP 依赖性 RNA 解旋酶 DDX42 与桩蛋白相互作用并调节 Ba/F3 细胞的凋亡和极化

摘要 Paxillin 是一种粘着斑衔接蛋白，在多个酪氨酸残基以及丝氨酸 273 (S273) 处高度磷酸化，并且已知对细胞骨架重排和细胞迁移至关重要。我们之前发现桩蛋白在 Ba/F3 细胞（一种小鼠​​ pro-B 细胞系）的 IL-3 依赖性存活中起调节作用。在这项研究中，通过使用过表达的 His6 标记的​​桩蛋白作为诱饵，我们发现 DDX42，一种 DEAD-box RNA 解旋酶，与桩蛋白相互作用，抑制细胞凋亡，并促进 Ba/F3 细胞的极化。His6 标记的​​桩蛋白在 Ba/F3 细胞中稳定过表达，用 Ni+-NTA 珠从细胞裂解物中提取，并通过一维 SDS-PAGE 和 LC-MS 进行分析。我们发现 DDX42 与桩蛋白共沉淀，正如用抗 DDX42 抗体对 His6 标记的​​桩蛋白沉淀物和带有抗桩蛋白抗体的 His6 标记的​​ DDX42 沉淀物的蛋白质印迹分析所证明的那样。此外，与 S273D 突变体相比，我们观察到 DDX42 与桩蛋白突变体 S273A 的优先相互作用。此外，DDX42 在 Ba/F3 细胞中的过表达延迟了 IL-3 剥夺诱导的细胞凋亡，并促进了 IL-3 再供给诱导的 Ba/F3 细胞在 6 小时剥夺后恢复细长形状。这些结果表明 DDX42 与桩蛋白相互作用并参与依赖于 IL-3 的细胞存活，以及参与 Ba/F3 细胞极化的细胞骨架重排。与 S273D 突变体相比，我们观察到 DDX42 与桩蛋白突变体 S273A 的优先相互作用。此外，DDX42 在 Ba/F3 细胞中的过表达延迟了 IL-3 剥夺诱导的细胞凋亡，并促进了 IL-3 再供给诱导的 Ba/F3 细胞在 6 小时剥夺后恢复细长形状。这些结果表明 DDX42 与桩蛋白相互作用并参与依赖于 IL-3 的细胞存活，以及参与 Ba/F3 细胞极化的细胞骨架重排。与 S273D 突变体相比，我们观察到 DDX42 与桩蛋白突变体 S273A 的优先相互作用。此外，DDX42 在 Ba/F3 细胞中的过表达延迟了 IL-3 剥夺诱导的细胞凋亡，并促进了 IL-3 再供给诱导的 Ba/F3 细胞在 6 小时剥夺后恢复细长形状。这些结果表明 DDX42 与桩蛋白相互作用并参与依赖于 IL-3 的细胞存活，以及参与 Ba/F3 细胞极化的细胞骨架重排。