A crucial step in the molecular detection of viruses in clinical specimens is the efficient extraction of viral nucleic acids. The total yield of viral nucleic acid from a clinical specimen is dependent on the specimen's volume, the initial virus concentration and the effectiveness provided by the extraction method. Recent Next Generation Sequencing (NGS)-based diagnostic approaches (i.e. metagenomics) provide a molecular 'open view' into the sample, as they theoretically generate sequence reads of any nucleic acid present in a specimen in a statistically representative manner. However, since a higher virus-related read output promises better sensitivity in the subsequent bioinformatic analysis, the extraction method selected determines the reliability of diagnostic NGS. In this study nine commercially available kits for nucleic acid extraction were compared regarding the simultaneous isolation of DNA and RNA by real-time PCR,four of which were selected for subsequent comparison by NGS (QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAamp cador Pathogen Mini Kit and QIAamp MinElute Virus Spin Kit). The nucleic acid yields and the sequence read output were compared for four different model viruses comprising Reovirus, Orthomyxovirus, Orthopoxvirus and Paramyxovirus, each at defined but varying concentrations in the same sample. The total amount of nucleic acid was processed to sequence the RNA (as cDNA) and the DNA with quantification by Qubit and virus-specific quantitative real-time PCRs. NGS libraries were prepared for sequencing on the Illumina HiSeq 1500 system. Finally, the percentage of reads assignable to each virus was determined via mapping. Evaluation of different commercial nucleic acid extraction kits with four different viruses indicates little variation in the read numbers obtained for transcribed RNA or DNA by NGS. Since NGSis increasingly being used as a tool in diagnostics of infectious diseases, the individual steps of the complete process have to be validated carefully. Here we could show that for virus identification in liquid clinical specimens, any nucleic acid extraction kit that is performing well for PCR diagnostics can be used for NGS diagnostics as well and that the selection of the kit has only a minor impact on the yield of viral reads.

中文翻译：

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比较病毒宏基因组提取方法。

临床标本中病毒分子检测的一个关键步骤是有效提取病毒核酸。临床样本中病毒核酸的总产量取决于样本的体积、初始病毒浓度和提取方法提供的有效性。最近基于下一代测序 (NGS) 的诊断方法（即宏基因组学）为样本提供了分子“开放视图”，因为它们理论上以具有统计学代表性的方式生成样本中存在的任何核酸的序列读数。然而，由于较高的病毒相关读取输出在随后的生物信息学分析中保证了更好的灵敏度，因此选择的提取方法决定了诊断 NGS 的可靠性。本研究比较了 9 种市售的核酸提取试剂盒，通过实时 PCR 同时分离 DNA 和 RNA，其中选择了 4 种进行 NGS 后续比较（QIAamp Viral RNA Mini Kit、QIAamp DNA Blood Mini Kit、 QIAamp cador Pathogen Mini Kit 和 QIAamp MinElute Virus Spin Kit）。比较了四种不同模型病毒的核酸产量和序列读数输出，这些病毒包括呼肠孤病毒、正粘病毒、正痘病毒和副粘病毒，每种病毒在同一样品中的浓度都在确定但不同。对核酸总量进行处理，以通过 Qubit 和病毒特异性定量实时 PCR 对 RNA（作为 cDNA）和 DNA 进行测序。NGS 文库已准备好在 Illumina HiSeq 1500 系统上进行测序。最后，通过映射确定可分配给每种病毒的读取百分比。用四种不同病毒对不同的商业核酸提取试剂盒进行评估表明，通过 NGS 获得的转录 RNA 或 DNA 的读取数几乎没有变化。由于 NGSi 越来越多地被用作传染病诊断的工具，因此必须仔细验证整个过程的各个步骤。在这里我们可以证明，对于液体临床标本中的病毒鉴定，任何在 PCR 诊断中表现良好的核酸提取试剂盒也可以用于 NGS 诊断，并且试剂盒的选择对病毒的产量影响很小读。用四种不同病毒对不同的商业核酸提取试剂盒进行评估表明，通过 NGS 获得的转录 RNA 或 DNA 的读取数几乎没有变化。由于 NGSi 越来越多地被用作传染病诊断的工具，因此必须仔细验证整个过程的各个步骤。在这里我们可以证明，对于液体临床标本中的病毒鉴定，任何在 PCR 诊断中表现良好的核酸提取试剂盒也可以用于 NGS 诊断，并且试剂盒的选择对病毒的产量影响很小读。用四种不同病毒对不同的商业核酸提取试剂盒进行评估表明，通过 NGS 获得的转录 RNA 或 DNA 的读取数几乎没有变化。由于 NGSi 越来越多地被用作传染病诊断的工具，因此必须仔细验证整个过程的各个步骤。在这里我们可以证明，对于液体临床标本中的病毒鉴定，任何在 PCR 诊断中表现良好的核酸提取试剂盒也可以用于 NGS 诊断，并且试剂盒的选择对病毒的产量影响很小读。必须仔细验证整个过程的各个步骤。在这里我们可以证明，对于液体临床标本中的病毒鉴定，任何在 PCR 诊断中表现良好的核酸提取试剂盒也可以用于 NGS 诊断，并且试剂盒的选择对病毒的产量影响很小读。必须仔细验证整个过程的各个步骤。在这里我们可以证明，对于液体临床标本中的病毒鉴定，任何在 PCR 诊断中表现良好的核酸提取试剂盒也可以用于 NGS 诊断，并且试剂盒的选择对病毒的产量影响很小读。