大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical
Chemistry上的文章，Small-Scale
Serial Size Exclusion Chromatography (s3SEC) for High Sensitivity Top-Down
Proteomics of Large Proteoforms [1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。自上而下蛋白质组学质谱（Top down
proteomics MS）已经成为能够表征由基因突变、可变剪接和翻译后修饰（PTMs）产生的proteoforms的主要技术。然而，目前该领域面临的两个主要挑战是高分子量proteoforms的分析和从少量样品中检测proteoforms。分析高分子量proteoforms的主要障碍是其信噪比（S/N）会随着分子量的增加呈指数下降，这可归因于信号在多个电荷态和同位素分布上的分散。此外，在复杂的混合物中，小蛋白质的共流出进一步抑制了大蛋白质的信号，从而加剧了信号的总体降低。为了克服这些限制，通常采用基于尺寸的分离方法从低质量成分中分离出高质量成分。尽管基于凝胶的技术实现了不同分子量组分之间的良好分离，但使用SDS需要在质谱分析之前进行样品除盐，这一步骤降低了通量和蛋白质回收率。为了应对这些挑战，作者开发了一种称为小型连续尺寸排除色谱法（small-scale serial
size exclusion chromatography, s3SEC）的技术，该方法可以从最少量的样品中完成基于尺寸的proteoforms分离，而无需额外的分离后样品处理过程。实验流程如图1所示，首先使用HEPES缓冲液（pH 7.4）去除胞质蛋白，然后将组织颗粒在TFA缓冲液（pH 2.0）中均质以富集心肌蛋白。将20 μg总蛋白样品注入两个连续连接的2.1 mm i.d
PolyHEA色谱柱（1000/300
Å）上。紫外检测后，将1 min的组分收集到LC-MS小瓶中，每个组分约150 ng，随后进行高灵敏度毛细管RPLC-MS/MS分析。![]()
为了从最少量的组织样品中提取蛋白质，作者选择使用2.1 mm i.d.的色谱柱进行s3SEC分离，该色谱柱在分离效率和样品消耗之间提供了一个强有力的平衡，这是分析复杂混合物的关键。此外，与300
Å柱相比，1000 Å柱能够更有效地分离高质量成分。在串联1000 Å和300 Å柱后，包含两种不同孔径的总柱长为1-4分离组分中的大蛋白质提供了额外的分离，同时也使5-12组分中较低质量区域的分离效果更好。实验中设置较低的流速（29
μL/min）可以与较小的柱径兼容，并且有利于减少分离后样品处理过程。每个分离组分（f#）对应的总离子流图（TICs）和传统的1D-RPLC分析相比显示出独特的图谱，表明每组分离成分中存在不同的蛋白质，进一步验证了离线分离的成功（图2B）。此外，每个部分的色谱图在不同的生物重复中是一致的，证明了离线分离和在线RPLC-MS分析的可重复性。在比较1D-RPLC TIC和F1 TIC时，作者观察到32.2−32.8 min的色谱图中有明显的变化（图2C）。在1D-RPLC谱图中对特定洗脱窗口进行分析后，质谱图对应心肌和骨骼肌alpha-actin（41.8 kDa）。然而，当在F1组分中对相同的洗脱窗口进行分析时，发现存在一个大蛋白质的电荷态分布特征，经过去卷积和计算确定其质量约为223.1
kDa（图2D），与肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）的理论分子量相符。在F2中，作者能够检测到以前未检测到的质量为154.8 kDa的蛋白异构体（图2F）。这些结果表明，s3SEC-RPLC-MS/MS方法能够检测到传统1D-RPLC方法无法检测到的高分子量蛋白质。![]()
图2. s3SEC-RPLC分析传统1D-RPLC方法无法检测到的高分子量proteoforms除了检测以前未观察到的高分子量蛋白外，s3SEC-RPLC方法还有利于提高使用1D-RPLC方法检测到的大蛋白的S/N。由于减少了与较小蛋白质的共洗脱，作者观察到了蛋白质信号的显著改善（图3）。在34.7-35.0
min洗脱窗口，1D和F3分析都能够检测到分子量为68.4
kDa的proteoforms。然而，1D-RPLC分析的质谱图显示，由于troponin
C的存在，较大蛋白的离子抑制明显增加（图3B）。尽管在F3的相同洗脱窗口中troponin
C仍然存在，但与1D-RPLC（2.6E4）观察到的强度相比，足够的基于尺寸的分离导致68.4
kDa proteoform的强度增加了11倍以上（3.1E5）。在35.0-35.5
min洗脱窗口中也观察到类似的趋势（图3C）。由于降低了蛋白质组的复杂性，增加的信号和最小化的共洗脱突出了使用s3SEC-RPLC-MS的另一个好处。此外，1D-RPLC方法中观察到的最大分子量为71.4
kDa，而s3SEC-RPLC-MS方法能够检测到223.1
kDa的蛋白质，有效地将可观察的质量范围提高了3倍以上。![]()
图3. 高分子量proteoforms s3SEC-RPLC-MS检测
s3SEC-RPLC-MS/MS方法除了能提高高分子量蛋白质的检测效率外，对低分子量proteoforms也可以实现等效或提升的碎片化效率，从而覆盖更宽的分子量检测范围。另外，这种二级采集模式是非靶向的，因此可以通过靶向方法，分离特定的前体离子和优化碰撞能量，实现更高的序列覆盖率。尽管该方法对高分子量proteoforms的检测有所提升，但事实证明，对大于60
kDa的蛋白质进行有效碎裂依然存在困难。前体离子的低S/N和LC时间窗口内发生洗脱相结合，导致高质量proteoforms的碎裂效率较低。大型蛋白质proteoforms的断裂被广泛认为是当前仪器和自上而下蛋白质组学分析的局限。总之，作者开发了一种s3SEC-RPLC-MS/MS方法，通过提供基于尺寸的分离，可以检测复杂混合物中的高分子量蛋白质。值得注意的是，该方法使用高灵敏度装置，降低了样品的消耗，同时在样品分离后无需任何的样品处理过程。该方法还可以表征低分子量蛋白质，拥有对不同分子量proteoforms进行相对定量的能力，未来在各种生物样本的应用中具有较大潜力。撰稿：张颖
编辑：李惠琳
文章引用：Rogers HT, Melby JA, Ehlers LE, et al. Small-Scale Serial Size Exclusion Chromatography (s3SEC) for High Sensitivity Top-Down Proteomics of Large Proteoforms. Anal Chem. 2024, 96, 2748-2753.
www.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献![]()
Rogers HT, Melby JA, Ehlers LE, et al. Small-Scale Serial Size Exclusion Chromatography (s3SEC) for High Sensitivity Top-Down Proteomics of Large Proteoforms. Anal Chem. 2024, 96, 2748-2753.