J. Am. Soc. Mass Spec.|PNGase Rc色谱柱用于氢氘交换质谱中复杂糖蛋白的在线去糖基化

原创陈凤平，李惠琳李惠琳课题组

大家好，本周为大家分享一篇发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry上的文章，Development of a PNGase Rc Column for Online Deglycosylation of Complex Glycoproteins during HDX-MS1,文章的通讯作者为哥本哈根大学药学院的Kasper D. Rand教授。

天冬酰胺残基(Asn)的糖基化(N -糖基化)是胞外蛋白质的主要翻译后修饰，也是真核生物中最普遍的糖基化形式。许多胞外蛋白作为药物靶标或生物制药的药物模型以N-糖基化的形式存在。因此，研究糖基化状态下蛋白质的结构和相互作用至关重要。然而，N-糖基化的存在增加了蛋白质的动力学和结构异质性，传统的蛋白质结构分析方法（如X射线晶体学和核磁共振等）往往不容易与天然糖基化蛋白质兼容。氢氘交换质谱法(HDX-MS)是研究动态或构象异构的蛋白质体系在溶液中的构象和相互作用的有力方法，但在糖蛋白的研究中也存在一些困难：如果蛋白含有多个高度异质或未知糖型的糖基化位点，则蛋白质的序列覆盖率会严重降低，显著影响HDX-MS分析糖蛋白的实用性。PNGase Rc是一种可以切割多种N-糖的酸性去糖基化酶，在HDX-MS鉴定糖蛋白中有巨大的应用潜力。本文中，作者开发了一种含有固定化PNGase Rc的色谱柱，可用于在线HDX-MS分析，以大大改善糖蛋白的鉴定。

为了评估PNGase Rc色谱柱在不同实验室的HDX-MS装置中的应用情况，将PNGase Rc色谱柱送往3个不同的实验室，分别对3种具有二硫键和复杂N -糖的糖蛋白(Hp 1-1、转铁蛋白和T细胞活化V结构域Ig抑制因子VISTA)进行HDX-MS实验。对于Hp 1-1，在没有在线去糖基化的情况下，α链的序列覆盖率为92%，β链的序列覆盖率为84.5%。其中β链鉴定出 66 种肽，但没有覆盖四个N-糖区域(N23、N46、N50、N80)中的任何一个。相比之下，使用PNGase Rc色谱柱，α链的序列覆盖率为100%，β链的序列覆盖率为98.8%。其中β链鉴定出 86 种肽，所有4个糖位点的全部覆盖(图1)。同样，VISTA和转铁蛋白用PNGase Rc柱进行HDX-MS分析，也得到了类似的效果，蛋白的所有N-糖位点都去糖基化，糖基化区域完全覆盖。

图1.PNGase Rc在线去糖基化后HDX-MS实验获得的Hp1−1的序列覆盖图。N-糖基化位点用橙色星号标记标记，去糖基化的多肽用橙色线段表示。

之后作者使用PNGase Rc色谱柱对单抗(mAb)与c-Met（一个具有挑战性的糖蛋白药物靶点，由525个氨基酸组成）的结合表位进行了 HDX-MS 映射。c-Met的HDX-MS实验鉴定到124个肽段，序列覆盖率达96.8%，6个糖基化位点全部覆盖。在与mAb结合前，对于六个糖基化区域，在41-50、102-117 和196-218中观察到缓慢的氘代，在83-95、96-100和147-159中观察到快速的氘代。结合mAb后，在跨越N202糖基化位点区域的几种肽中观察到HDX显著降低。c-Met的其他区域，包括另外5个N-糖基化区域，均未发现显著的氘代变化(图2)。因此，可以推测糖基化区域196-218与mAb的结合有明显的联系，表位很可能包含在该区域中。而在未使用PNGase Rc色谱柱去糖基化时，该区域无法用于HDX-MS分析。

图2.c-Met在线去糖基化的HDX-MS表位定位。(A)c-Met的序列覆盖图，其中含有N-糖基化位点（橙色星号表示）的去糖基化肽以橙色突出显示，红色突出显示的肽表示在单克隆抗体结合时氘代显著降低。(B)跨越N-糖基化位点的所有糖肽的氘代图，加入单抗的c-Met用红色曲线表示，不含单抗的c-Met用蓝色曲线表示。(C)将HDX-MS数据映射到c-Met晶体结构(PDB：1SHY)上，红色代表表位区域在mAb结合时氘代显著降低(195 -216)，N-糖基化位点用橙色标记。

最后，作者对PNGase Rc色谱柱的活性和可重用性进行了评估。以来自IgG1曲妥珠单抗的胰蛋白酶糖肽为底物，使用LC-MS分析法测定PNGase Rc色谱柱的活性及可重用性。为了探究PNGase Rc柱在不同温度下的活性，作者在0℃和室温(20℃)下测定了其效率。结果表明，室温下PNGase Rc色谱柱的脱糖基化效率为99%，0℃时其效率降低到72%(图3B)。PNGase Rc色谱柱在0℃下仍可获得较高的去糖基化效率，在HDX-MS实验中具有较好的应用前景。之后作者在114天的时间间隔内，用LC-MS定期监测糖肽的糖基化和脱糖基化形式的强度来评估PNGase Rc色谱柱的可重用性。从去糖基化肽和糖基化肽的强度可以清楚地看出，即使在正常使用PNGase Rc柱114天后，总的去糖基化效率仍然很高(图3C,D)。其中糖基化肽的强度在第34、68和110天之间的波动可能是由于在第68和110天使用不同的底物批次引起的。此外，使用相同的LC-MS测定法研究了PNGase Rc色谱柱在含有较高浓度TCEP和尿素（2.5 M和3 M尿素以及200 mM和400 mM TCEP）的淬灭缓冲液中的去糖基化效率。结果表明，与对照组（不含TCEP和尿素）相比，暴露于高浓度的TCEP和尿素会导致去糖基化效率有所下降(图4)，但这种去糖基化效率的降低是完全可逆的。

图3.PNGase Rc柱的可重用性和温度依赖性监测。(A) LC-MS法检测PNGase Rc柱的活性。(B)当以200 μL/min 的流速置于HDX内部(0 ℃)和外部(20 ℃)时，PNGase Rc 色谱柱的活性。(C,D)糖肽的去糖基化和糖基化形式的强度(通过LC-MS测定)。

图4.PNGase Rc色谱柱在不同浓度的TCEP和尿素存在下的去糖基化效率。

总的来说，作者所开发的PNGase Rc色谱柱能够在糖蛋白的HDX-MS实验中高效地在线去除N-连接聚糖。对于四种复杂糖蛋白(Hp 1-1、VISTA、转铁蛋白、和c-Met)的HDX-MS实验，使用PNGase Rc色谱柱，序列覆盖率都得到显著提高，能够覆盖以前无法分析的所有糖基化区域。此外，本文还展示了 PNGase Rc谱柱如何能够定位c-Met上的表位。最后，该色谱柱在TCEP和尿素等常见淬灭缓冲剂的存在下仍能保持高活性，并且在114天的连续使用中表现出较好的稳定性。

撰稿：陈凤平

编辑：李惠琳

文章引用：Development of a PNGase Rc Column for Online Deglycosylation of Complex Glycoproteins during HDX-MS

李惠琳课题组网址

www.x-mol.com/groups/li_huilin

参考文献

Lambert, T., et al., Development of a PNGase Rc Column for Online Deglycosylation of Complex Glycoproteins during HDX-MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2023. 34(11): 2556-2566.

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