m6A与CAF

今天小编给大家带来一篇刚刚发表在International Journal of Biological Sciences（IF：10.75）的文章。这篇文章主要研究了m6A修饰与CAF在转移中的作用。下面让我来看一下详细内容。

研究发现CAF通过上调非小细胞肺癌细胞中m6A的修饰来促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。NSCLC细胞中的甲基转移酶METTL3介导CAFs对m6A的修饰，并受CAFs分泌的血管内皮生长因子VEGFA的调节。非小细胞肺癌细胞中的METTL3基因敲除显著抑制了细胞的迁移和侵袭，并抑制了体内肿瘤的生长。METTL3与肺癌预后不良有关。机制研究表明，METTL3可增加RAC3 mRNA的m6A水平，增加RAC3 mRNA的稳定性和翻译性。RAC3可能通过AKT/NF-κB途径促进细胞迁移。

肺癌是全球最致命的癌症，肺癌的主要病理类型是非小细胞肺癌，占肺癌病例的85%。NSCLC主要包括肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)和大细胞癌。尽管近年来治疗取得了进展，但肺癌的死亡率仍然很高。由于转移是肺癌相关死亡的主要原因，因此迫切需要深入了解肺癌转移的机制。

肿瘤微环境(TME)在肿瘤的发生、发展中起着至关重要的作用。肿瘤细胞和TME之间的相互作用可促进肿瘤的生长。癌症相关成纤维细胞(CAF)是TME中的主要间质细胞，它们通过分泌细胞因子和外泌体刺激肿瘤进展。以前的研究还发现，CAF通过分泌KRT8和HMGB1促进肺癌细胞的转移。

表观遗传修饰，已经成为各种生理和病理过程的关键调节因子。在各种mRNA甲基化中，m6A是最丰富的RNA修饰。m6A甲基化对RNA的命运起着重要的作用。研究表明，m6A基因的异常修饰参与了疾病的进展，m6A修饰有助于癌症的进展。

CAF影响肺癌进展的不同机制已被揭示；然而，是否涉及m6A甲基化还没有得到评估。在这项研究中，作者发现CAFs通过调节NSCLC细胞中m6A甲基化来促进NSCLC细胞的转移潜能，并证明了CAFs对m6A甲基化的影响。并且确定RAC3为MetTL3的修饰靶点，RAC3通过AKT/NF-κB信号途径刺激非小细胞肺癌细胞迁移。

CAF促进NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭

为了探讨CAF对非小细胞肺癌细胞的影响，从肺癌组织和癌旁组织中采集CAF和正常成纤维细胞，制备CAF-CM(条件培养液)和NF-CM(条件培养液)。作者选择了三个非小细胞肺癌细胞系：A549细胞(腺癌)、H1299细胞(癌)和H661细胞(大细胞癌)。

实验显示CAF和NFs均可促进NSCLC细胞的生长，且CAF的作用强于NFS（图1A）。并且CAF促进了NSCLC细胞的集落形成特性(图1B，C)。肿瘤细胞的转移潜能取决于它们的迁移和侵袭能力。采用wound healing（创伤愈合）实验和Transwell实验观察NSCLC细胞的迁移和侵袭行为。由于CAF促进细胞增殖，为了排除这种对细胞迁移和侵袭的影响，用0.05μM丝裂霉素C预处理细胞，抑制细胞增殖，大约85%-90%的细胞存活。创面愈合实验表明，CAF和NFs均能促进细胞迁移，但CAF更有效(图1D，E)。在Transwell试验中也观察到了类似的结果(图1F，G)。综上，CAF增强了NSCLC细胞的生长和转移潜能。

图1 CAF促进NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭

CAF增加NSCLC细胞中m6A的修饰

很多研究表明m6A的异常修饰参与了肿瘤的发生和发展，但CAF是否影响肺癌细胞中的m6A修饰尚不清楚。为了解CAF对肺癌细胞m6A修饰的影响，作者用CAF-CM和NF-CM处理NSCLC细胞。CAF和NFs均提高了NSCLC细胞中m6A的修饰水平，但CAF更为有效。(图2A-C)。

作者进一步对CAF-CM的肺癌细胞进行了MeRIP-seq。结果显示，CAFs显著增加了m6A修饰共识5’-RRACH-3’基序的甲基化，导致CAFs处理细胞中m6A水平的提高(图2D-F)。上述结果表明，CAF提高了NSCLC细胞中m6A的修饰。

图2 CAFs可增加NSCLC细胞m6A的修饰

METTL3在NSCLC细胞中介导m6A修饰

作者发现无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平，CAF显著增加了NSCLC细胞中甲基转移酶METTL3和去甲基酶FTO和ALKBH5三种调控因子的表达水平(图3A)。由于CAFs提高了m6A的修饰水平，因此作者更关注甲基转移酶METTL3。为了确定METTL3在肺癌细胞m6A修饰中的作用。dot blot印迹分析显示，当METTL3过表达时，m6A水平升高，而当METTL3被下调时，m6A水平下降，这表明METTL3将m6A修饰引入了肺癌细胞(图3B，C)。然后，作者用CAF-CM处理METTL3基因敲除细胞。结果表明，METTL3基因敲除减弱了CAFs对m6A修饰的增强，表明CAFs通过METTL3上调了m6A修饰水平(图3C)。

相比较正常细胞，METTL3在肺癌细胞系中高表达，当比较配对的肿瘤组织和非肿瘤组织中的METTL3水平时，METTL3水平显著高于非肿瘤组织（图3D，E），这表明METTL3可能促进肺癌的进展(图3E)。为了验证这一假设，在肺癌细胞中降低了METTL3的表达，并测量了细胞的生长、迁移和侵袭。与对照组相比，METL3基因敲除显著抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭(图3F-H)。

接下来作者评估了METTL3在非小细胞肺癌患者中的临床意义。TCGA数据显示与健康对照组相比，METTL3在LUAD和LUSC患者中都高度表达(图3I)。在LUAD和LUSC中，肿瘤组织中METTL3的表达水平都显著高于正常组织；但在N0期和N1-N2期之间，METTL3的表达没有显著差异，表明METTL3与淋巴结转移状态无关，GEO数据表明METTL3高表达与肺癌患者的低生存率相关(图3J，K)。综上所述，METTL3通过调节m6A的修饰参与了NSCLC的进展。

图3 METTL3介导NSCLC细胞m6A甲基化

CAF通过分泌VEGFA上调NSCLC细胞METTL3水平

虽然CAF增加了NSCLC细胞中m6A的水平，但CAF是如何调节NSCLC细胞中m6A水平的尚不清楚。VEGFA在肿瘤进展中起着关键作用。作者首先检测了CAF和肺癌细胞释放的VEGFA水平。ELISA结果显示，两种细胞分泌的VEGFA均高于肺癌细胞，其中CAF的VEGFA分泌量最高(图4A)。为了探讨VEGFA对肺癌细胞METTL3表达的影响，作者在DMEM/F12细胞中加入重组VEGFA，或在CAF-CM中加入VEGFA中和抗体，并将其用于培养肺癌细胞。添加重组VEGFA的DMEM/F12显著增加了METTL3的表达，这与CAF-CM相似，而添加VEGFA中和抗体的CAF-CM显著减弱了CAF-CM对METTL3表达的刺激作用（图4B，C）。这些结果表明，CAFs通过分泌VEGFA提高了NSCLC细胞的METTL3水平。

图4 CAFs通过分泌VEGFA使METTL3水平升高

CAF促进RAC3的m6A修饰和表达

RNA-seq数据显示，CAFs治疗组中有397个基因上调，219个基因下调(图5A-C)。KEGG通路分析表明，差异表达基因主要集中在mTOR、AMPK、蛋白质消化吸收和药物代谢等通路中(图5D)。通过分析RNA-seq数据和MERIP-seq数据，作者进一步研究了在mRNA水平和m6A水平都变化的基因。我们发现了增加了mRNA表达的73个超甲基化的m6A峰，并将这些峰称为hyper-up基因。还发现了167个hyper-down基因、37个低上调基因和15个hypo-down基因(图5E)。

由于m6A修饰可能会增加基因表达，作者筛选了hyper-up基因，特别是可以刺激细胞生长的基因。其中RAC3基因的m6A水平和mRNA水平均增加，这与MERIP-seq和RNA-seq结果一致（图5F，G）Western blotting结果表明，CAF上调了3种NSCLC细胞系中RAC3蛋白的表达，同时上调了METTL3的表达(图5H)。此外，肺癌组织中的RAC3水平高于配对的癌旁组织，并在LUAD和LUSC组织中显著上调（图5I，J）。并RAC3水平与淋巴结转移状态的相关性。在LUAD中，N0-N2期肿瘤组织中RAC3水平明显高于正常组织；同样，LUSC中N0-N3期肿瘤组织中RAC3水平显著高于正常组织，而N0期和N1-N2期肿瘤组织中RAC3水平无显著差异，提示RAC3与淋巴结转移状态无关(图5K)。这些结果表明CAF促进了RAC3的m6A修饰和表达，而RAC3与NSCLC的转移无关。

图5 CAFs增加m6A甲基化和RAC3的表达

METTL3增强RAC3基因m6A甲基化及其稳定性

为了评估METTL3和RAC3转录本之间的直接相互作用，进行了RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR检测。与对照抗体IgG相比，METTL3特异性抗体显著增加了RAC3的mRNA，CAF-CM显著增强了这种结合（图6A）。MeRIP-qPCR结果进一步表明，METTL3过表达显著增加了RAC3 mRNA中m6A的修饰。而当METTL3在肺癌细胞中被敲除时，CAFs对m6A修饰的增加被减弱(图6B)。

METTL3基因敲除降低了RAC3的mRNA水平，而METTL3过表达则增加了RAC3的转录。用CAF-CM处理METTL3基因敲除细胞。当METTL3减少时，CAF对RAC3转录的刺激作用被阻断（图6C）。

此外，我们通过用放线菌素D处理细胞来研究METTL3对RAC3 mRNA稳定性的影响。RAC3 mRNA的表达最初被降低；METTL3的沉默加速了mRNA的衰退，而强制表达METTL3则逆转了这些影响(图6D)。此外，在蛋白质水平上，METTL3基因的敲除显著降低了RAC3的蛋白质水平；相反，METTL3的过表达显著增加了RAC3的蛋白质水平(图6E)。CAF增加了RAC3的表达；然而，当METTL3被下调时，这种影响被缓解(图6E)。这说明METTL3甲基化了RAC3 mRNA，并通过防止降解来维持其稳定性，这导致了RAC3表达的增加。CAF以CAF-METTL3-m6A修饰依赖的方式增加RAC3的表达。

图6 METTL3增强m6A甲基化和RAC3 mRNA的稳定性

CAF通过RAC3介导的AKT/NF-κB途径促进非小细胞肺癌细胞迁移

CAF-CM使p-AKT和p-P65水平升高，而总AKT和P65水平不变（图7A）。当METTL3被敲除时，CAF-CM对AKT/NF-κB通路没有影响。当AKT抑制剂Perifosine或NF-κB抑制剂JSH23预处理细胞时，CAF对细胞迁移的促进作用显著减弱，METTL3基因敲除减弱了CAF的促进作用(图7B)。

已有研究表明RAC3参与了肿瘤的侵袭和转移。当RAC3在肺癌细胞中被敲除时，CAF促进的迁移作用减弱。相反，当RAC3在肺癌细胞中过表达时，CAF促进了迁移(图7C)。RAC3的沉默抑制了CAF对AKT/NF-κB通路的激活，而RAC3的过表达则增强了AKT/NF-κB通路的激活（图7D）。

图7 CAF通过RAC3介导的AKT/NF-κB途径促进非小细胞肺癌细胞迁移

抑制METTL3减弱CAFs对肺癌体内生长的影响

作者首先通过慢病毒感染建立了稳定的METTL3基因敲除细胞系A549-METTL3-KD。并通过Western blotting检测METTL3基因敲除的效率(图8A，B)。评估METTL3在细胞生长中的作用。如所示，肺癌细胞中METTL3表达的减少显著抑制了细胞的生长、迁移和侵袭（图8C-E）。

接下来，作者将小鼠分为A549细胞组、A549细胞+CAFs组、A549-METTL3-KD细胞组和A549-METTL3-KD细胞+CAFs组。CAF显著刺激肿瘤生长。有趣的是，我们观察到A549-METTL3-KD细胞不形成肿瘤。这与我们的体外研究一致，该研究表明METTL3抑制抑制了肺癌细胞的生长（图8F，G）。值得注意的是，当肺癌细胞中的METTL3被敲除时，CAF对肿瘤生长的刺激作用显著减弱。

此外，作者利用肿瘤组织研究了其潜在的机制。免疫组织化学分析显示，CAFs可增加肿瘤组织中METTL3和RAC3的表达(图8H)。dot blot分析显示，CAF显著增加肿瘤组织中m6A的水平；然而，METTL3基因敲除取消了这一作用(图8I)。此外，CAF上调了转移相关基因MMP9和Twist1，上调了RAC3，并激活了AKT(图8J)。这些发现与我们的体外研究结果一致，提示CAF通过METTL3介导的m6A修饰RAC3 mRNA，并激活转移相关基因和AKT途径，促进肺癌生长。

图8 抑制METTL3减弱CAFs对肺癌体内生长的影响

作者研究表明CAF通过依赖m6A修饰的调控机制促进NSCLC细胞的转移潜能，而METTL3在NSCLC细胞中介导m6A修饰。进一步确定RAC3是METTL3的下游靶点，RAC3通过AKT/NF-κB途径促进非小细胞肺癌细胞的迁移，提示RAC3 m6A修饰可能成为肺癌治疗的潜在治疗靶点(图8K)。