Mol Cell｜人自噬启始和脂质转移的蛋白质构象转变

撰文｜风

自噬是一个降解胞内功能失调的细胞组分的保守过程，对于应对胁迫和维持稳态发挥重要作用。自噬分为巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy）。自噬的本质是细胞内膜成分重排的过程。对于巨自噬，隔离膜（phagophore）首先生成于膜结合点（membrane sites），例如内质网（endoplasmic reticulum, ER），内质网-线粒体结合点（ER-mitochondria contact sites），内质网-高尔基体中间室（ER-Golgi intermediate compartment）等，隔离膜逐渐延伸并包裹需要降解的物质形成具有双层膜结构的自噬小体（autophagosome），自噬小体随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome）降解内容物，最后，自噬溶酶体部分成分分选回收，称为自噬性溶酶体再生（autophagic lysosome reformation，ALR）和自噬体成分循环（autophagosomal components recycling, ACR）【1,2】。

在自噬诱导后，一系列复杂的蛋白质或蛋白质复合体通过未知机制迅速定位并介导Atg9+囊泡与内质网形成膜结合位点,这是自噬启始和自噬体形成的关键一步【3】。这里面主要包括3种蛋白组分，ULK复合体，三型PI3K激酶复合体I和跨膜三聚体Atg9。目前研究认为，自噬信号诱导条件下，ULK1复合体（ULK1-Atg13-FIP200-Atg101）附着在内质网的Ω小体（omegasome）处，并募集Atg9+囊泡与其他蛋白或蛋白复合体共同作用形成稳定的膜结合点，其中，Atg2-Atg18介导脂质从内质网向囊泡外叶的运输，虽然越来越多涉及此过程的蛋白被鉴定出来，如Atg13，Atg14，Atg21，Atg18，Atg11和Atg9等，但是，其组装的分子细节仍然不清楚，这些蛋白复合体如何形成一个功能性结合位点？这个稳定的结合点怎么组装和解聚？不同组分如何协同完成功能？隔离膜如何完成延伸扩张？

2023年5月19日，来自德国马克思-普朗克多学科科学研究所（国际十大细胞自噬著名研究院所和高校之一）的Alex C. Faesen在Molecular Cell杂志上在线发表题为Metamorphic proteins at the basis of human autophagy initiation and lipid transfer的研究文章。该论文在体外重建人7亚基自噬启始超复合体Atg9-Atg13-Atg101-FIP200-ULK1-Atg14-BECN1，并揭示其核心复合体Atg9-Atg13-Atg101的组装需要Atg13和Atg101蛋白不同折叠构象之间的转变，其缓慢自发的蛋白形变是这个过程的限速步骤。Atg9-Atg13-Atg101核心复合体与ATG2-WIPI4的结合有助于膜囊泡的结合停留以及促进Atg2介导的脂质转移，进而促进隔离膜向自噬小体的形成。

首先，研究人员在体外纯化Atg9，Atg13和Atg101全长蛋白和Atg13的HORMA结构域（Atg13^HORMA），混合Atg9和过量的Atg13-Atg101复合体可以形成稳定的Atg9-Atg13-Atg101复合体，结合质谱测定发现ATG9-13-101复合体是按照3：6：3的化学计量比组装。作者进一步证实Atg13，Atg101和Atg13-Atg101复合体都可以和Atg9蛋白的C端结合（Atg9^C），另外，Atg13可以和Atg9蛋白的N端（Atg9^N）作用，但Atg101无此现象。有意思的是，当Atg13与Atg9^N结合时，则不能再与Atg101结合。总之，作者证实Atg9^C可以与Atg13和Atg101以及Atg13-Atg101复合体结合，但是当Atg13与Atg9^N结合时，则失去与Atg101结合的能力。

图1

Atg13和Atg101都是具有HORMA结构域的蛋白，这种结构域具有约200个氨基酸，其结构特点是N端-结构域核心（domain core）-安全带（safety belt/seabelt）C端（图1）【4】，具体来说，就是3个α螺旋（α-helices）支撑的3个β片层（β-sheet）组成的核心，及柔性的N和C末端。一般来说，这种结构域存在无活性的开放状态和有活性的关闭状态两种构象，默认状态是开放状态，当有客户蛋白（client protein）结合时，其C端的安全带可以在“抱住”客户蛋白以稳定复合体，并使其处于关闭的激活态，进而开启下游信号。基于此，作者推测Atg9-13-101复合体生成时可能存在构象的转变。作者在实验中发现，当混合Atg9和Atg13或Atg101时，复合体需要在20℃时孵育18-24h才能形成，这表明Atg13和Atg101在默认条件下是非Atg9结合构象，只有在一定时间内发生构象转变后才能结合Atg9。但是，Atg13和Atg101的结合却可以在瞬时完成，表明Atg13和Atg101在默认条件下是可结合构象。正如上介绍，二聚体化可能是引起HORMA结构域构象转变的触发因素之一，而实验也证实Atg13和Atg101在形成复合体之后可以使其与Atg9^FL或Atg9^core+C的结合时间减少到30分钟，但并不能加快Atg13与Atg9^N的结合。进一步，作者通过位点突变（ATG13^ΔN和ATG13^Δseatbelt）改变Atg13的默认构象，这些突变体均失去与Atg101的迅速结合能力。和Atg13^wt优先结合Atg101不同，ATG13^Δseatbelt则优先结合Atg9^N，这个数据表明Atg13与其客户蛋白结合并不依赖其C端安全带，这一点和其他HORMA蛋白不同。另外，Atg13^wt4℃过夜不能诱导其构象转变，因为其依然优先结合Atg101而非Atg9^N，相反，ATG13^Δseatbelt则可以快速转变为优先结合Atg101而非Atg9^N，这些数据表明Atg13的C端安全带却可以稳定其构象，敲除后可以导致构象转换更为容易。使用阴离子交换色谱方法，作者可以分离不同构象的Atg13及其突变体也证明了此现象。基于上述结果，作者提出了一种ATG9-13-101复合体组装的“移交模型”（hand-over model），即Atg13和Atg101在默认状态下快速结合为Atg13-Atg101复合体并继续结合Atg9^C，随后Atg13发生构象转换，Atg101将其转移给Atg9^N，之后Atg101结合新的Atg13分子并将3聚体的Atg9位点饱和填充，最终获得化学计量比为3：6：3的ATG9-13-101复合体（图2）。

图2

紧接着，为了研究上述的蛋白构象转变是否可以影响细胞自噬，作者在小鼠胚胎成纤维细胞MEF中敲除Atg13或者Atg101之后再转染相应的ATG13^Δseatbelt或ATG101^ΔN及其相应的WT蛋白载体，发现无论WB检测的LC3-II和P62代表的自噬流还是免疫荧光检测的LC3B和Atg16L puncta，在ATG13^Δseatbelt或ATG101^ΔN细胞中均显著降低。总之，Atg13和Atg101蛋白构象转变的确影响自噬。之后，作者在体外纯化ULK1，FIP200，Atg14，BECN1，Atg2和WIPI4，并证明ATG9-13-101作为核心构架，形成ULK复合体-PI3K复合体-Atg2-WIPI4自噬启始超复合体（图3）。

图3

研究表明，Atg2-WIPI4可以介导脂质从ER向隔离膜的转移，并在Atg9具有爬行酶（scramblase）活性促进脂质在隔离膜内外叶之间转移的辅助下进一步使隔离膜扩张【5-7】。作者使用大单室脂质体（Large unilamellar vesicles, LUVs）技术发现Atg9和Atg13-101可以促进Atg2介导的脂质转移（图3）。

综上所述，这项研究在体外重塑了自噬启始复合体，并阐明Atg9-13-101作为核心复合体参与组装自噬启始超复合体，同时Atg13和Atg101的构象变化是Atg9-13-101复合体组装的限速步骤，Atg13和Atg101可以促进Atg2介导的脂质转移，总之，这些证据进一步提供了自噬启始的机制。

制版人：十一

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