大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Journal
of the American Chemical Society上的文章，Structural Mass Spectrometry Probes the
Inhibitor-Induced Allosteric Activation of CDK12/CDK13-Cyclin K Dissociation1。该文章的通讯作者是中科院大连化物所的王方军教授。
周期蛋白依赖性激酶12和13（CDK12、CDK13）通过与细胞周期蛋白K（CycK）结合磷酸化RNA聚合酶II的羧基末端来促进转录的延伸以及mRNA的加工。CDK12和CDK13的异常表达常常与多种肿瘤疾病相关。开发靶向CDK12以及CDK13的抑制剂是目前肿瘤药物研发的热点。截至目前，大多数针对CDK12/CDK13的小分子抑制剂都是ATP的竞争性抑制剂，这些抑制剂在肿瘤治疗模型中均显示出一定疗效，但却由于其耐药或药代动力学较差而未投入临床使用。对CDK12/CDK13-CycK复合物进行变构调节是设计高选择-低毒性CDK抑制剂的新思路，但却受限于常规结构生物学工具无法捕捉由抑制剂引起的蛋白复合物构象变化。因此，本文整合结构质谱：赖氨酸反应活性谱（LRP）与非变性质谱（nMS）用于表征由抑制剂引发的CDK12/CDK13-CylinK复合物的构象变化（图1）。图1 LRP和nMS揭示抑制剂诱导的CDK12/CDK13-CycK解离的变构激活示意图
如图2ab为CDK12/CDK13-CycK与不同抑制剂孵育后赖氨酸反应活性谱。可以观察到不同抑制剂组总体趋势一致，说明它们与CDK12/CDK13的结合方式相似。对于CDK12（图2a），与抑制剂结合后K874的标记量明显下降，说明该位点位于结合位点附近，抑制剂通过增强近端非共价相互作用对其结构起稳定作用，该位点表面可及性降低，标记量也下降。对比CDK12-CycK的晶体结构可以看到，K874刚好位于ATP的结合口袋附近，说明这些抑制剂都与ATP发生竞争，并结合在相同的口袋上（图2c）。值得注意的是，不同效能的抑制剂导致K874位点标记量不同程度的下降，IC50值越小的抑制剂对应的标记量下降越大（图2d），由此K874位点标记量的变化可作为评估抑制剂结合强度和抑制效果的定量指标。除了CDK12的K874位点，CDK12的K1021以及CDK13的K852、K1005位点都具有类似的抑制活性评估功能（图2ab），在此不再赘述。图2 定量比较不同抑制剂对(a) CDK12-CycK和(b) CDK13-CycK复合物赖氨酸标记反应活性(NLE)的影响。(c) CDK12的Lys874、 CDK13 的Lys852和Lys1005(红色)和THZ531结合口袋(绿色)的位置关系(PDB: 5ACB, 7NXJ)。(d)不同抑制剂的IC50值 (nM)与CDK12的Lys874和CDK13的Lys852位点赖氨酸反应活性变化(|ΔNLE|)的相关性。
与赖氨酸反应活性下降一样，赖氨酸反应活性上升也暗示蛋白复合物构象的变化。如图2ab所示,CDK12的K764、K776位点和CDK13的K742、K754位点在与抑制剂THZ531和SR-4835结合后标记水平明显提高，根据晶体结构显示（图2c），这些位点主要位于CDK12/CDK13-CycK结合位点附近，暗示抑制剂THZ531和SR-4835可能影响了蛋白CDK12/CDK13与CycK的结合。随后，作者用nMS分析证实了这个猜想。如图3ab所示，在谱图中可以观察到较高的复合物CDK12/CDK13-CycK信号，游离的CycK信号较弱，而CDK12不溶于水，暂时观察不到信号。当抑制剂SR-4835加入后，CDK12-CycK-SR4835复合物的信号出现，CDK12-CycK的信号下降，而游离CycK的信号明显上升，说明SB-4835与CDK12的结合诱导了CDK12-CycK复合物的解离，细胞水平的免疫共沉淀实验也显示出了同样的结果（图3e），SR-
4835的结合诱导了CDK12-CycK和CDK13-CycK复合物的解离，由于游离的CDK12/CDK13不具有激酶活性，因此CDK-CycK解离的变构激活可能是SR-4835的一种新抑制机制(图3f)。![]()
图3 (a,b)
CDK12/CDK13-CycK蛋白复合物的nMS谱。(c,d)在复合物/抑制剂SR-4835浓度比为1:3的条件下CDK12/CDK13-CycK蛋白复合物的nMS谱。CycK、CDK12/CDK13-CycK和CDK12/CDK13-CycK-SR-4835的质谱峰分别用蓝色、橙色和绿色显示。(e) CDK12/CDK13-CycK复合物在细胞水平被SR- 4835破坏。(f) SR-4835诱导CDK12/CDK13-CycK解离变构激活原理图(PDB: 5ACB)。
总之，本文整合整合结构质谱用于表征由抑制剂引发的CDK12/CDK13-CylinK复合物的构象变化，发现SR-
4835可以通过与CDK12/CDK13的ATP结合口袋结合来诱发CDK12/CDK13-CycK复合物解离，从而发挥抑制作用。这种变构调节机制可为CDK12/CDK13药物开发和设计提供新思路。
撰稿：刘蕊洁
编辑：李惠琳
原文：Structural Mass
Spectrometry Probes the Inhibitor-Induced Allosteric Activation of
CDK12/CDK13-Cyclin K Dissociationwww.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献![]()
Bai
Y, Liu Z, Li Y, et al. Structural Mass Spectrometry Probes the
Inhibitor-Induced Allosteric Activation of CDK12/CDK13-Cyclin K Dissociation. J
Am Chem Soc. 2023;10.1021/jacs.3c01697.