CRISPR-Cas系统因其简便性及高效性，已被广泛用于基础生命科学研究、遗传疾病治疗及作物性状改良等领域。作为抵御细菌病毒和外源遗传物质侵入的适应性免疫系统，细菌及部分巨噬菌体在亿万年的适应性进化中发展出许多不同的CRISPR-Cas系统，目前已发现超过30种不同的亚型【1】。II型CRISPR-Cas9和V-A型CRISPR-Cas12a是目前使用率最高的两种CRISPR-Cas系统。但是，Cas9和Cas12a蛋白较大（>1200氨基酸），大小超过AAV递送系统的包装极限，极大地限制了其在体基因治疗的应用。近年来，V-F亚型CRISPR-Cas12f系统因其极小的体型（约400~700个氨基酸大小）和高特异性而备受关注。然而，现在报导的Cas12f系统在真核细胞中的编辑活性还相对较低，并且其对PAM的识别特异性较高导致可靶向范围窄，从而限制了它们的进一步应用【2-7】。因此，亟待开发新的高活性且可靶向范围更广的CRISPR-Cas12f系统。 2023年4月11日，辉大（上海）生物科技有限公司（简称，辉大基因）创新研究院研发团队在Nature Communications期刊发表了题为Engineered CRISPR-OsCas12f1 and RhCas12f1 with robust activities and expanded target range for genome editing 的研究论文。该研究综合利用生信大数据挖掘、高通量筛选、蛋白质和sgRNA定向改造、PEM-seq脱靶分析技术及体内外基因治疗有效性分析等技术手段，开发了两个在哺乳动物细胞中具有高活性、靶向范围广且高保真的新型CRISPR-Cas12f系统：enOsCas12f1（433 a.a.，识别5’-TTN PAM）和enRhCas12f1（415 a.a.，识别5’-CCD PAM）。基于enOsCas12f1，研发团队又开发了可诱导激活的DD-enOsCas12f1、表观编辑器（miniCRISPRoff）和基因表达激活器（denOsCas12f1-VPR）。该研究不仅丰富了基因编辑工具箱，更重要的是对基因编辑领域进一步迈入“迷你时代”有着重要的意义。 研究人员首先通过高通量哺乳动物细胞功能鉴定平台对34种之前未被报导的CRISPR-Cas12f1系统进行了编辑活性鉴定，从中筛选得到6个具有哺乳动物细胞活性的新型CRISPR-Cas12f1系统。其中，OsCas12f1和RhCas12f1编辑活性最好，且它们都有非常迷你的体型，分别只有433个氨基酸和415个氨基酸。为进一步提高OsCas12f1和RhCas12f1的活性，研究人员对OsCas12f1、RhCas12f1的蛋白和sgRNA分别进行了定向改造，开发得到高活性版本enOsCas12f1和enRhCas12f1。通过头对头比较，发现enOsCas12f1效率远高于已报导活性最好的Cas12f（Un1Cas12f1_ge4.1），部分靶点能实现90%以上的切割效率，并且靶向范围更广。 为了解决Cas12f在体内长期表达的潜在风险，研究人员通过将可降解结构域与enOsCas12f1融合，开发得到化学小分子TMP诱导型DD-enOsCas12f1。在人源化DMD模型小鼠体内，研究人员通过单个AAV递送方式发现enOsCas12f1和DD-enOsCas12f1介导的exon51删除能有效恢复dystrophin蛋白的表达。DD-enOsCas12f1的活性在体内受到TMP的调控。值得一提的是，TMP作为FDA认证安全的化学小分子，为DD-enOsCas12f1进一步应用于疾病治疗提供了良好基础。此外，基于enOsCas12f1切割活性缺失突变体——denOsCas12f1，研究人员进一步开发得到表观编辑器（miniCRISPRoff）和基因表达激活器（denOsCas12f1-VPR），在哺乳动物细胞中验证了其活性，实现了不产生DSB的高效基因表达调控。 辉大基因创新研究院孔祥锋博士、张海南博士、李国玲博士、汪子康博士和孔旭强为本研究论文的共同第一作者，王乐聪等积极参与课题并作出了重要贡献。辉大基因创始人&首席科学顾问杨辉研究员、辉大基因创新研究院院长周英思博士为该论文通讯作者。
参考文献
1. Makarova, K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol18, 67-83 (2020).2. Bigelyte, G. et al. Miniature type V-F CRISPR-Cas nucleases enable targeted DNA modification in cells. Nat Commun 12, 6191 (2021).3. Wu, Z. et al. Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. Nat Chem Biol17, 1132-1138 (2021).4. Xu, X. et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol Cell81, 4333-4345 e4334 (2021).5. Kim, D.Y. et al. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nat Biotechnol40, 94-102 (2022).6. Wang, Y. et al. Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease.Cell Rep 40, 111418 (2022).7. Harrington, L.B. et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science362, 839-842 (2018). 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37829-7