PBJ | 生物燃料高产量有望！利用不同因子的表达组合调控浮萍中三酰甘油的积累

原创 Z.HF 植物生物技术Pbj

浮萍科也称为浮萍，是水生单子叶植物科。浮萍的快生长速率使得它们成为生物燃料原料生产的目标。为了满足生长时对新膜的需求，它们的复叶有很高的脂肪酸合成速率，但是三酰甘油（TAG）的积累仍保持在很低的水平。

三酰甘油（TAG）的能量密度是淀粉的两倍以上。对于大多数生物质作物而言，营养组织占植物总生物量的很大比例，因此，在植物营养组织中积累TAG是生产生物燃料用TAG高产的一种有吸引力的策略。浮萍中几乎所有的植物生物量都由漂浮叶状复叶中的光合作用活性组织组成，如果对其进行基因改造，则可能以单位土地面积的高产量生产TAG。

近日，国际著名杂志Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Engineering Triacylglycerol Accumulation in Duckweed (Lemna japonica)”的文章，作者发现通过不同因子的表达组合可以改变浮萍TAG的累积量。在复叶中共同表达推、拉和保护因子CFP-AtWRI1、MmDGAT和SiOLE（*）时，相对于未转化的亲本WTL累积TAG的水平显著增强。该发现为优化浮萍中TAG的积累提供了基础，并为生产生物燃料和类脂生物产品提供了新的思路。

（1）基因表达的优化

作者为了缓解与WRI1的过表达对浮萍的形态和生长的影响，使用基于雌激素受体的XVE系统诱导表达，将GFP融合到拟南芥WRI1（GFP-WRI1）的N末端增强其在烟草叶片中表达的稳定性。为了进一步提高AtWRI1的表达，对Anemonia majano CFP进行了密码子优化，并将其n端融合到atwr1 (CFP- atwr1)。使用共焦显微镜检查确定了优化的CFP AtW RI1成功表达并靶向正确。（图1）

图1

图2

（2）生成SiOLE（*）、CFPAtWRI1和MmDGAT的单、双和三组合转化子

作者使用Golden Gate组装制作用于转换的一级（L1）和二级（L2）构造（图2）。含有BAR和EYFP（L2-0，EV）的“空载体”被用作阴性对照。SiOLE（*）、CFP-AtWRI1和MmDGAT单基因构建物或浮萍转基因系分别指定为L2-6（O）、L2-22（W）和L2-24（D）。二元组合命名为L225（OW）、L2-27（OD）和L2-31（WD），这三个基因的组合被命名为L2-33（OWD）。通过农杆菌介导的转化，将含有SiOLE（*）、CFP-AtWRI1和MmDGAT组合的结构转化为WT L.japonica的愈伤组织。分别从构建物EV、O、W、D、OW、OD、WD和OWD中获得阳性转基因株系。

（3）雌二醇诱导CFP-AtWRI1的表达

作者为了诱导L.japonica复叶中TAG的积累，在进行定量脂质分析之前，仅对含有CFP-AtWRI1和WT阴性对照（WT+E）的转基因株系进行雌二醇诱导。在这项中试实验中，在OWD线（33-6）上进行了5天的诱导过程，浓度为100μM雌二醇处理4天，导致最高的TAG积累（图S3）。在随后的实验中，使用100μM雌二醇对两个独立的代表性CFP-AtWRI1进行为期4天的诱导，每个构建体都含有转基因株系，如图3所示。

图3

图4

（4）SiOLE（*）、CFP-AtWRI1和MmDGAT的过度表达显著增加了L.japonica复叶中的总脂肪酸含量和TA G积累

将转基因株系的TFA或TAG水平与WT或EV对照进行比较，在四种评估的组合（OW、OD、WD、OWD）中，组合OWD和OD分别在TFA和TAG中具有最高和第二高的测量水平，相对来说单基因表达的转基因系测量水平最低，并且TAG含量存在协同效应。（图3）

（5）转基因品系显示出脂肪酸谱的明显变化

由于脂肪生成基因的异源表达可以改变脂肪酸谱，作者确定了每个代表品系的谱（图3c）。

图5

图6

（6）含有WRI1的几个基因组合对生长速度有抑制作用。

作者发现即使WRI1的背景表达也会导致生长抑制，但这仅适用于OW和WD，而不适用于W和OWD。除生长速率的影响外，还观察到形态效应。（图5）

（7）SiOLE（*）、CFP-AtWRI1和MmDGAT的转录水平

作者通过进行RT-qPCR以确定转基因的标准化相对转录水平。单个表达MmDGAT的株系中MmDGAT的表达水平与MmDGAT与SiOLE（*）和/或CFP-AtWRI1共表达时的表达水平相似。然而，当单独表达时，SiOLE的转录物积累低于用MmDGAT或CFP-AttWRI1表达时的转录物。相反，雌二醇诱导的CFP-AtWRI1表达在单独表达时高于用MmDGAT或SiOLE表达时（*）。Western blot测定的不同转基因系中CFP-AtWRI1的蛋白质丰度与其转录表达模式一致。但这一观察结果与上述协同研究结果一致，证实了W与O、D或OD的组合比O和D的组合具有更少的协同效应。（图6）

浮萍可以积累显著水平的TFA和TAG，并且相对于未转化的亲本WTL，在复叶中共同表达CFP-AtWRI1、MmDGAT和SiOLE（*）时，TAG增加了两个以上数量级。与这三个基因的过度表达相反，与未转化的WT或EV对照相比，单个、W、D和O基因的表达并没有显著提高TFA积累。但野生型和转基因株系的长期保存问题仍有待解决。转基因浮萍的生物抑制是高油浮萍工业化生产的一个重要问题。

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