CAR-T疗法、TCR-T疗法研发格局
文章目录：
一、T细胞疗法发展历史
二、TCR-T疗法简介
三、CAR-T疗法简介
四、CAR-T疗法的毒性控制
五、T细胞疗法的未来
六、T细胞疗法研发企业
七、小编总结
近年来，T细胞介导的免疫疗法越来越受欢迎，免疫检点抑制剂和CAR-T疗法更是让大药企以及资本趋之若鹜。根据clinical.gov的数据，截至发稿日，全球范围内进行的CAR-T疗法临床研究达到282项。本文主要参考CAR-T疗法大牛“六爷”（Carl H June）的文章，梳理T细胞疗法的历史、现状，同时梳理产业界的竞争格局。
最早成功应用的癌症过继细胞疗法是在1956年，E. Donnall Thomas教授利用双胞胎间的骨髓移植来治疗白血病，避免了移植物抗宿主反应（GVHD），为此与约瑟夫·默里一起获得1990年的诺贝尔生理学或医学奖。不同宿主间的骨髓移植，又经过了十几年的探索，组织相容性抗原配型的研究发现，使得不相关个体间的骨髓移植成为可能，并于1979年在西雅图成功实现了不相关个体间的骨髓移植。直到今天，骨髓移植仍然是许多类型白血病的主要疗法。但骨髓移植不仅价格高昂，而且仍然有很大风险发生GVHD，很多时候甚至是致命的。
▲E. Donnall Thomas教授
2002年，美国国家癌症研究所（NCI）的Steven Rosenberg教授从癌症患者的肿瘤组织中提取了肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），体外扩充培养后回输到患者体内，治疗转移性黑色素瘤。TIL疗法有很多限制：不是所有患者的肿瘤组织都会产生淋巴细胞，提取的淋巴细胞不一定有抗肿瘤活性，即便有抗肿瘤活性患者也不一定能等待8周的时间以扩充培养这些淋巴细胞。因此，尽管有高达50%的治疗响应率，TIL疗法没能获得更广泛的应用。
▲Steven Rosenberg教授
这些限制促使研究人员寻求具有更广泛意义的T细胞。TIL疗法前后治疗数百例黑色素瘤患者的过程中，研究人员发现不同患者的TIL同样可以识别一些肿瘤细胞高表达抗原如MART-1、gp100等。基于这些发现，针对这些特定抗原的T细胞将具有潜在的治疗效果。这些尝试，将T细胞疗法推向靶向时代和重组改造时代。
Steven Rosenberg研究组选取了一个黑色素瘤患者的2个TIL细胞克隆DMF4、DMF5。这两种细胞系都对MART-1/HLAA*02(A2)有亲和力。患者的外周血T细胞被收集起来，并通过反转录病毒导入DMF4的TCR基因。这种方法避免了TIL复杂的分离过程，初步临床试验结果在2006年发表，12个黑色素瘤患者中有2位患者有治疗响应。尽管响应率远低于TIL疗法，但初次证实了基因改造的T细胞具有治疗效果。
TCR亲和力
TCR的亲和力是否是一个重要因素呢？由于DMF4的TCR对于MART-1的亲和力比较低，高亲和力的DMF5-TCR进行了又一项临床试验。治疗响应率达到30%（6/20），当然由于患者数少，也不能明确说亲和力高的TCR一定有更好的疗效。同时要注意，DMF5-TCR的毒性更大，出现了视力、听力、皮肤毒性。与这些部位正常组织表达的MART-1相关。
适应症拓展
继MART-1靶点的TCR-T疗法后，针对其他适应症的CEA、NY-ESO-1、MAGE靶点的TCR-T疗法陆续进入临床研究。Robbins等人开发的靶向NY-ESO-1的TCR-T疗法先后用于转移性黑色素瘤和滑液细胞瘤。治疗响应率分别为55%（11/20）和61%（11/18）。在宾大，“六爷”（Carl H June）研究组开发的靶向NY-ESO-1的TCR-T疗法用于多发性骨髓瘤，治疗响应率达到80%（16/20）。
截止到2016年末，TCR-T疗法已经陆续被应用于多种适应症的临床研究：包括是到期、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、滑液细胞瘤等。这些正在进行的临床试验统计如下表。
精细的平衡
NCI 进行的靶向CEA的TCR-T疗法临床研究，3个病人有1例治疗响应，但3人都出现了严重的炎症反应-大肠炎。可能是由于大肠正常组织也表达CEA。
靶向MAGE的TCR-T疗法则有3项已完成的临床研究，如表一所示。NCI进行的靶向MAGE-A3的临床研究，有3位患者出现精神状态改变，其中2人陷入昏迷最终死亡。尽管这项研究中TCR是通过响应MAGE-A3呈递得到的，但已知MAGE-A9与MAGE-A12也有交叉反应活性。死后病理检查显示脑部大量T细胞浸润，同时证实脑部正常组织表达MAGE-A12，所以这个副作用很可能与此相关。
超生理状态TCR亲和力的风险
宾大进行一项靶向MAGE-A3的TCR-T疗法，用于治疗2例多发性骨髓瘤和1例黑色素瘤。TCR经过筛选，提高了亲和力。开始接受治疗的2例患者出现了心源性的休克并死亡。病理结果发现T细胞大量浸润导致心肌死亡坏死，而心脏组织是不表达MAGE-A3的。随后通过心肌细胞培养发现存在与MAGE-A3 TCR的交叉反应。进一步研究发现罪魁祸首是肌联蛋白-Titin，其产生了类似于MAGE-A3的多肽。这个案例提醒我们，TCR亲和力提高存在脱靶的风险，TCR-T疗法的应用要更加小心。
非自身抗原
除了自身抗原，也有研究人员开始尝试将TCR-T疗法用于外源抗原，如HPV的病毒抗原等。
TCR-T疗法展示了一定的治疗潜力，但仍有诸多限制，如组织相容性抗原配型、抗原需要呈递到细胞表面等。CAR-T疗法的出现大大拓展了T细胞疗法的应用范围。
三代CAR的发展
CAR-T疗法的概念最早来自于Zelig Eshhar教授（以色列人，德国洪堡大学教授）。
▲Zelig Eshhar教授
Zelig Eshhar提出将抗体的轻重链连接到T细胞表面TCR的恒定区上，随后又将scFv替换轻重链，避免了多次重复的转基因。这就是第一代CAR-T疗法，随后陆续应用到临床上。
然而这些早期的临床研究没有获得理想的效果，响应率不佳，而且在靶向CAIX的CAR-T疗法中，出现了胆源性毒性的副作用，意味着CAR-T存在作用于正常组织中靶标引起毒性的风险。
CAR-T疗法的第一个积极临床结果于2008年公布，位于休斯敦的Baylor医学院的Malcolm Brenner研究组，靶向GD2的CAR-T疗法，尽管24小时血液中CAR-T细胞含量不足0.1%，仍使得11名儿科成神经细胞瘤患者中的3人完全缓解。随之而来的一个主要问题是如何保持CAR-T细胞的长期存活。
二代CAR-T引入了共刺激信号4-1BB或CD28，前者通过上调Bcl-xL延长T细胞的存活期，后者可以增强T细胞响应的效价。三代CAR-T引入2个以上的共刺激信号。
第一个三代CAR-T的临床研究为靶向HER2的CAR-T疗法，适应症为转移性黑色素瘤（表二）。HER2靶点在单抗领域已经成功应用多年，赫赛汀成功治疗超过40万名女性乳腺癌患者，表现出很小的毒性。基于这些经验，NCI选择将靶向HER2的scFv应用到CAR-T疗法上，用于治疗HER2+ 黑色素瘤。首例患者接受了高浓度的CAR-T细胞：1*1011个细胞。患者接受治疗后，几分钟后就表现极为痛苦，很快陷入昏迷，X光显示严重的费浸润。医生给予高剂量激素敢于，患者仍在5天后死亡。随后发现患者全身遍在CAR-T细胞，肺部最为严重。进一步分析肺部上皮细胞表达HER2，可能是导致肺部T细胞浸润引发死亡的主要原因。
CD19：成功的故事
HER2 CAR-T致患者死亡的案例对于CAR-T靶点选择产生了巨大的影响。CAR-T的靶标选择更加谨慎，科学家希望找到只在肿瘤细胞表达的靶标。这些尝试给了CD19、CD20发挥作用的机会，这是B细胞的两种分化抗原。第一个被尝试的是CD20，不过没有表现出明显的疗效，紧接着就是CD19的登场，CAR-T的光芒注定开始闪耀了。
2007、2008、2009年，Michel Sadelain（Baylor）、Carl H June（宾大）和Steven Rosenberg（NCI）研究组分别报道了CD19 CAR-T的临床前研究结果。2010年，Steven Rosenberg研究组的James Kochenderfer发表了CD19 CAR-T初步临床研究的结果，这项研究是基于CD28共刺激信号的二代CAR-T疗法，用于治疗晚期滤泡淋巴瘤（FL）。这项研究最后由8名患者参与，6名患者出现缓解。5名患者接受治疗后CAR-T在PBMC中含量超过1%，10天后达到峰值，一个月后含量回落到0.01%以下。
▲Michel Sadelain教授
2011年，宾大的Carl H June教授发表了一例基于4-1BB共刺激信号、靶向CD19的二代CAR-T治疗案例，适应症为慢性粒细胞性白血病（CLL）。患者完全缓解，同时由于细胞因子风暴有发热症状。CAR-T的疗效持续达8周之久，有趣的是，患者接受的CAR-T细胞只有1.42*107个，比之前常用的剂量（109~1011）低了2-3个数量级。
▲Carl H June教授
同样在2011年，Renier Brentjens和Michel Sadelain（Baylor）发表了基于CD28共刺激信号、靶向CD19的二代CAR-T疗法，患者包括慢性粒细胞性白血病（CLL）和急性粒细胞性白血病（ALL），治疗剂量是107个/kg体重。大部分患者在接受治疗24h内出现发热，多数是暂时性的，只有1位患者持续发热最终死亡。死亡原因不明，但可能与之前已存在的脓毒症有关。
1例CLL患者出现缓解，疗效维持6个月；1例ALL患者出现缓解，但后来进行了骨髓移植治疗排除出试验。值得注意的是，接受治疗2周后，血液中都检测不到CAR-T细胞存在。
看到CAR-T的成功，更大规模的临床试验在FL、CLL、ALL及其他B细胞相关的恶性肿瘤患者中开展。这其中尤其值得注意的是多发性骨髓瘤的成功研究。
尽管多发性骨髓瘤（MM）被认为是一种B细胞疾病，但通常认为这是一种完全分化的、CD19阴性的B细胞疾病。2015年，Carl H June教授研究组的Alfred Garfall 和 Edward Stadtmauer发表了1例多发性骨髓瘤患者接受基于4-1BB共刺激信号、靶向CD19的CAR-T治疗的案例。这名患者是以为43岁的女士，经过9种化疗治疗和干细胞移植治疗，接受CAR-T治疗的时候，她的骨髓95% MM，99.95%的B细胞是CD19阴性的。CAR-T治疗剂量是5*107个，100天后骨髓中肿瘤细胞完全消失。科学家猜想可能0.05%的CD19阳性B细胞具有干细胞性质，是肿瘤细胞自我更新的基础。因此靶向CD19的CAR-T疗法可以治疗多发性骨髓瘤。
CD19之外的血液肿瘤靶点
尽管CD19 CAR-T已经表现了颠覆性的进展，仍有一些患者出现CD19靶标丢失以及治疗后复发，因此仍有必要寻找新的血液肿瘤靶点。靶向CD138、BCMA治疗骨髓瘤，靶向CD33、CD123治疗急性粒细胞性白血病（AML）的CAR-T疗法处在临床研究阶段。
双刃剑
活化的T细胞会产生大量的细胞因子：干扰素α、干扰素γ、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等。这些细胞因子会引起各种身体反应：发热、低血压、募集和激活更多免疫细胞导致更坏的后果甚至死亡。这种情况被称为细胞因子风暴（Cytokine release syndrome， CRS）。
Emily Whitehead是第一例接受CAR-T治疗的儿科ALL患者，宾大的CAR-T临床试验将Emily的白血病完全治愈。Emily当时处于白血病末期（ALL），接受CAR-T治疗四天后，Emily发了高烧，血压快速下降危及生命，第5天住进ICU。科学家和医生团队们不知道如何治疗，因为不知道原因何在。他们连夜测定了Emily体内细胞因子的水平，发现很多细胞因子都升高，IL-6升高幅度最大。医生讨论后给Emily注射了脱利珠单抗，一种IL-6R抗体药物。几乎是立刻，Emily的血压上升，退烧，其他症状也都回复正常。如今，Emily已经11岁，是一个完全健康的儿童。
▲CAR-T治愈的儿科患者 Emily Whitehead
还有很多情况下，细胞因子风暴无法有效处理，需要科学家对CRS进行更深入的研究和干预。如Juno领先的CAR-T疗法JACR015在2015年出现2例脑水肿死亡案例，这种情况下更难处理，如脱利珠单抗无法突破血脑屏障来干预脑部的副作用。
大胆探索“无人区”
CAR-T疗法在白血病领域的成功激发了大药企的兴趣，他们投入大量资金与研究机构合作推动CAR-T的临床研究。2013年，Fred Hutchinson、纪念斯隆·凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院的科学家联手成立了Juno。宾大携手诺华开发CAR-T疗法，Kite则与NCI合作。礼来、葛兰素史克、强生、默克通过投资介入CAR-T领域。其他的CAR-T研发型企业包括BlueBird、Bellicum、Cellectis等，后文将一一介绍其技术特点。
CAR-T疗法在实体瘤领域遇到了很多困难，一度使得人们认为CAR-T不适用于实体瘤。如表二所示，目前二代/三代CAR-T疗法仅有2个案例研究和1项19人的临床研究。其中唯一的三代CAR-T实体瘤应用是由Steven Rosenberg's（NCI）研究组来进行的，治疗剂量为107个靶向HER2的CAR-T细胞，患者为复发性转移性黑色素瘤，可以患者由于正常组织靶点介导的严重副作用死亡。
另一个临床研究是靶向HER2的二代CAR-T疗法，由Baylor进行，入组19名复发性转移性肉瘤患者。该项研究中剂量使用更为谨慎，为104~108个，最高剂量人比NCI的案例低3个数量级。尽管没有副作用，但该研究也没能显示治疗效果。
首个靶向不同抗原（mesothelin，间皮素）的二代CAR-T来自宾大，用于治疗2例患者：1例恶性胸膜间皮瘤、1例转移性胰腺癌。尽管没有显示毒性，但只在恶性胸膜间皮瘤患者显示了暂时性的抗肿瘤效果。至今为止，其他经报道的实体瘤CAR-T疗法都是CD19 CAR-T成功前的第一代CAR-T疗法，他们几乎无效或者只有微弱的疗效。
自身抗原的尴尬
HER2 CAR-T疗法是一个生动的教训，提示我们T细胞的效价可以有多强，和单抗药物显示完全不同的安全风险。由于肿瘤细胞来自正常细胞，很难找到只在肿瘤细胞表达而在正常细胞完全不表达的靶点。正如已经尝试过的MART-1、gp100、CEA等一度认为是肿瘤特异性的，最后发现在正常组织也会有表达。
容易摘的果实
多形性成胶质细胞瘤（glioblastomamultiforme）的生存期只有15个月，三分之一的肿瘤细胞表达突变的肿瘤特异性抗原，这样靶向EGFRvIII的CAR-T疗法就成为一种理想的选择。因为EGFRvIII是一种肿瘤特异性的突变蛋白，正常细胞不可能表达，但不能完全避免EGFR与EGFRvIII的交叉活性反应。提高安全性的主要任务就是筛选对EGFRvIII高活性、对EGFR低亲和力的scFv。
宾大的Carl H June研究组开发了基于4-1BB共刺激信号、靶向EGFRvIII的CAR-T疗法，用于治疗多形性成胶质细胞瘤；NCI的Steven Rosenberg研究组开发了基于4-1BB和CD28共刺激限号、靶向EGFRvIII的CAR-T疗法，用于治疗晚期神经胶质瘤；杜克大学也开发了靶向EGFRvIII的CAR-T疗法，用于治疗多形性成胶质细胞瘤。具体见上表。
▲TCR-T疗法、CAR-T疗法临床研究一览
IL13Rα2是一种肿瘤特异性的靶标，针对这个靶点的CAR-T疗法经过十数年的研究。希望之城国家医疗中心（city of hope）的Michael Jensen研究组做了大量靶向IL13Rα2的研究工作。该研究组没有利用scFv，而是利用重组IL13（Zetakine）来靶向IL13Rα2。2015年，该研究组报道了临床研究结果：他们招募了13例GBM患者入组，不幸的是，DNA质粒电转、筛选、扩充培养耗费了3-4个月的时间，最终只有3位患者来得及接受CAR-T治疗。由于采取了肿瘤切除术，不确定治疗的效果，3位患者也在治疗一年内先后死亡。
再次探究自身抗原
理论上一些肿瘤靶标蛋白的表达会大幅上调，与正常组织存在很大差别，可以作为CAR-T的治疗靶点。一些靶向mesothelin、cMet、MUC1、GD2、EphA2、EGFR、CD171和CD133的CAR-T疗法正处在一期临床评价安全性的研究中。另外还有一些针对非肿瘤特异性表达、但在肿瘤微环境中特异性存在的靶点如FAP、VEGFR2的CAR-T疗法也在研究过程中。
“金发姑娘原则”
免疫系统本质上是一种平衡态，针对癌症进行免疫治疗一样要谨慎的平衡安全性与有效性。对于TCR-T疗法，只有靶标达到一定浓度，才能激活TCR下游信号。而CAR则不然。这是由于两者的作用方式不同，TCR：MHC-Peptide的相互作用一般在μmol级别，而scFv与表位的相互作用一般在nmol级别。如前文所述，NCI进行的MART-1 TCR-T疗法中，高亲和力的DMF5 TCR治疗响应率为30%，但毒性更强；低亲和力的DMF4 TCR治疗响应率为13%，但没有表现出毒性。
scFv与表位的亲和力也会因案例而异，但一般比TCR与MHC-peptide的亲和力高3个数量级。如宾大靶向EGFRvIII的scfv亲和力为101nM，而NCI靶向EGFRvIII的scFv亲和力为0.58nM。2015年，宾大的Yangbing Zhao教授和MD Anderson Cancer Center的Laurence Cooper教授（2015年任Ziopharm的CEO）在Cancer Research同一期发表了文章，研究内容都是引入突变到anti-HER2 scFv进行亲和力改造，进而在体外和小鼠体内研究改造对CAR-T造成的影响。有趣的是，两者都发现了亲和力的“sweet spot”，改造后只识别肿瘤细胞的高表达抗原，而不识别正常细胞的低表达抗原。这项研究成果被Baylor的临床研究证实：改造后的靶向不同表位的HER2 CAR-T在19例患者治疗中没有发现毒性。
▲Yangbing Zhao教授
RNA CAR
首个HER2 CAR-T疗法造成的死亡是的研究人员更为谨慎，一种控制安全性的策略是控制CAR-T细胞的暴露时间。宾大的Carl H June研究组开发了一种靶向间皮素的CAR RNA疗法，将RNA通过电转化导入T细胞，这样CAR 蛋白只会表达7天左右的时间。但这种方法过于复杂，而且通常需要连续几次的注射才有可能看到治疗效果。
给药途径
另一种减轻毒性的方法是肿瘤组织内注射，但这种方法只适合尚未发生转移、只分布在特定部位的肿瘤。这种方法比较适合GBM这种脑瘤，这样T细胞就不太会透过血脑屏障进入全身，避免发生更多副作用。2016年12月29日，新英格兰医学杂质发表了Michael Jessen研究组的成果，1位50岁的胶质母细胞瘤患者接受局部注射IL13Rα2 CAR-T的治疗后，取得良好进展。
▲IL13Rα2 CAR-T治疗后局部肿瘤的控制
降低剂量
Baylor试图通过降低剂量来解决毒性问题，鉴于NCI 的HER2 CART高剂量（1011个）导致患者死亡，Baylor 在NCT02442297种的剂量降低至107~108个，另一项治疗HER2阳性的恶性肿瘤试验（Bucket trial）剂量最低至104个。Baylor认为通过筛选病毒特异性的记忆T细胞会更有利于安全性，不过这种方法耗时更长更繁琐，关于细胞的筛选对安全性的影响也没有定论。
细胞自杀系统
另一种限制毒性的机制是scFv的免疫原性，导致其清除。NCI的鼠源gp-100 TCR显示确实产生了人抗鼠抗体（HAMA）。但这个机制不能解释CD19 CAR-T疗法中CAR-T细胞的衰减，因为该疗法在清除血液里的肿瘤细胞的同时也会清除正常的B细胞。血液里所有B细胞都被清除，也就无法产生抗体，自然无法清除CAR-T细胞。然而在实体瘤的CAR-T疗法研究中，免疫原性又称为一个治疗障碍，CAR-T疗法已经有许多人源化以减少免疫原性的尝试。这些矛盾的现象需要进一步深入研究。
科学家更多尝试利用非免疫原性的方法来控制CAR-T细胞的活性，传统的方法是使用大量激素，但有时候激素不足以控制细胞因子风暴。许多研究团队进而开发了CAR-T的开关系统。如MSKCC开发的一种CAR-T疗法开关，在CAR-T细胞同时包含一种Caspase9蛋白，这种蛋白只有在二聚体情况下才有活性，而二聚体的形成是某种特定的小分子药物介导的。使用这种药物后，Caspase 9蛋白会二聚化，活化后的Caspase 9蛋白会介导CAR-T下包的凋亡。从而达到作为CAR-T疗法开关的目的，这种开关设计还有很多，后文CAR-T企业介绍中会涉及到多种不同的CAR-T开关。
免疫检点抑制剂、T细胞疗法是肿瘤免疫疗法的两大突破性进展。T细胞疗法中，刺激性信号4-1BB、CD28、OX-40、CD27、ICOS等已经被正和岛CAR-T疗法中，增强T细胞活性，延长存活周期。另一方面，针对抑制性信号的免疫检点抑制剂抗体如PD-1/PD-L1抗体已经取得了许多突破性进展。CAR-T、TCR-T疗法在某些患者没能产生治疗响应，其区别也仅仅是T细胞对肿瘤细胞不响应，不能产生IFN-γ等细胞因子。由此猜想可能是抑制性信号发挥了抑制T细胞响应的作用。2016年9月，Carl H June研究组发表了PD-1抗体与CAR-T联用的研究，PD-1抗体可以增强CAR-T疗法的疗效。
100种实体瘤本质上就是100种不同的疾病，这些差异性给T细胞疗法带来许多挑战。需要更多的基础研究以探索发病机制，如胰腺癌的屏障来自于基底组织，GBM则分泌TGF和T细胞抑制因子。幸运的是，资本的涌入极大促进了T细胞疗法的发展，传统化疗、放疗及新兴的免疫检点抑制剂，联用的协同效应给癌症治疗带来更多选择。未来的方向还不得而知，但免疫治疗的前景一定是光明的。
宾夕法尼亚大学、美国癌症研究院（NCI）、Fred Hutchinson癌症研究中心、纪念斯隆·凯特琳癌症中心、和西雅图儿童医院等是最早开展CAR-T细胞疗法的研究机构。2013年，Fred Hutchinson、纪念斯隆·凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院的科学家联手成立了Juno。宾大则携手诺华开发CAR-T疗法。Kite则与NCI合作，从而形成了三巨头鼎立的局面。除此外，还有Bluebird、Celletis、Bellicum等多家企业布局CAR-T疗法。
附表 CAR-T、TCR-T疗法研发企业
除了CAR-T、TCR-T细胞疗法的研发企业外，大药企也对这个新兴领域虎视眈眈。前有诺华与宾大合作，后有安进成立自己的CAR-T疗法研发企业Atara，其他大企业则通过合作形式纷纷布局CAR-T/TCR-T疗法领域。
Juno在CAR-T细胞疗法领域与诺华、Kite处在第一梯队，并积极开展多项研发合作，保持技术领先及策略的灵活选择空间。Juno与纪念斯隆·凯瑟琳癌症研究中心（MSKCC，JACR015）、Fred Hutchison癌症研究中心（FHCRC，JACR014）、西雅图癌症研究所（SCRI，JACR017）积极开展合作，并在近两年先后收购了Stage Cell、AbVitro、Redox Therapies三家生物科技公司，最近则与张峰创办的Editas签订合作协议，Juno一系列密集布局旨在加强CAR-T领域的布局。中国市场方面，Juno与药明康德成立合资公司，共同在中国推进其细胞疗法项目的开发。
2016年7月6日，JCAR015在针对成人复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的Ⅱ期临床试验中导致2例患者脑水肿死亡而被叫停，Juno在7月8日前递交修订材料，7月12日，FDA审核后排出JCAR015产品本身问题，许可JACR015继续临床试验。FDA快速反应的积极态度，将该事件的负面影响降到最低。11月23日，Juno再次宣布暂停JACR015的临床研究，股价应声下滑30%。
产品布局方面，第一梯队为靶向CD19的CAR-T疗法：JACR015、JACR017、JACR014。JACR015在纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心开发，采用CD28作为共刺激因子，采用细胞为CD3+ PBMC，适应症为ALL、NHL；JACR017在西雅图癌症研究所开发，采用4-1BB作为共刺激因子，采用细胞为固定比例的CD8+ T细胞/CD4+ T细胞；适应症为儿科ALL、NHL；JACR014在Fred Hutchison癌症研究中心开发，采用细胞为固定比例的CD8+ T细胞/CD4+ T细胞。
除此外，Juno积极开发升级版的CAR-T疗法：双特异性的CAR-T疗法。第二个特异性受体可以是激活型信号也可以是抑制性信号。以抑制性信号iCAR为例，设计为特异性识别健康组织中存在的靶标蛋白，如下图中的antigen B，癌症组织中，CAR识别antigen A杀伤癌细胞，正常组织中，antigen B结合iCAR，启动抑制信号，T细胞不会杀伤带有靶标antigen A的正常细胞。这样就提高了CAR-T疗法的特异性和安全性。
CD19之外，Juno也在积极开发其他靶点的CAR-T疗法，如CD22、WT1等靶点，以开发针对不同适应症的产品。CAR-T疗法之外，Juno同时开发TCR-T疗法。
Juno pipeline
诺华的CAR-T技术源自宾夕法尼亚大学，前文已有具体阐述。2016年8月31日，诺华宣布解散细胞和与基因治疗部门，并入肿瘤研究部门。诺华宣诚CAR-T疗法的开发不收影响，但业界更倾向于相信诺华对CAR-T多少存在一些顾虑。诺华进展最快的CAR-T疗法为CTL019，属于第二代CAR-T疗法，胞内信号区共刺激信号为CD-3zeta和CD137。在2016年ASH会议上，诺华公布了CTL019二期临床数据，针对儿童和年轻人难治性复发性B-ALL的完全缓解率达到82%。副作用仍然严重，48%的患者出现了3级-4级的CRS，但没有出现治疗相关的死亡。15%的患者出现了3级神经毒性。
Kite Pharma的研发进度原本稍落后于Juno和诺华。2016年12月4日，Kite宣布其领先产品KTE-C19已经启动BLA滚动申报，适应症为不适合自体干细胞移植的复发性难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤，从而后来居上。
根据2016年9月26日公布的KTE-C19的二期临床研究中期数据（ZUMA-1），疗效达到预期：弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL，51位患者）总体反应率ORR达到76%，完全缓解率CRR达到47%；转移滤泡性淋巴瘤（TFL，11名患者）总体反应率ORR达到91%，完全缓解率达到73%。Kite希望能在2017年上市该产品，尽管CMO仍保持谨慎态度，主要是KTE-C19仍存在一些严重的安全性问题。此外，KTE-C19的疗效持续时间也是一个问题，3个月后总响应率和完全缓解率都出现明显下降，但是否如一期临床研究一样，3个月后的有效率不再发生明显变化，尚不得而知。
Kite与Cell Design Labs合作，引入小分子开关到新一代CAR-T疗法中。
Adaptimmune的前身是Avidex，其技术源自牛津大学。2006年，Avidex被Medigene收购，2008年，Adaptimmune分拆出来成为独立公司，并与宾大达成技术合作协议。2014年于葛兰素史克达成合作协议，随后完成1.04亿美元的A轮融资。2015年5月，Adaptimmune在纳斯达克上市，募资1.76亿美元。
Adaptimmune通过改造TCR的CDR域，提高TCR与靶点蛋白的亲和力。技术实现途径包括：确认特异性的靶标，首先确认癌细胞呈递的多肽，然后筛选掉正常组织中呈递的多肽，验证该多肽在癌细胞表面呈递；确认靶标后，建立IP保护的TCR噬菌体展示库，通过IP保护的二硫键方法改造后的TCR更加稳定并可溶，从中筛选高亲和力高特异性的TCR；筛选的TCR通过IP保护的临床前安全性测试技术验证，保证最小的off-target效应、Cross-activity（正常组织活性）。
从病人体内分离CD4、CD8细胞后，进行上述基因的改造。改造后的T细胞通过DynaBeads® CD3/CD28 beads技术进行扩增，最后冻存备用。
基于上述技术平台，Adaptimmune开发了靶向NY-ESO、MAGE-A10等的TCR-T细胞疗法，并在2014年6就NY-ESOTCR-T项目与GSK签订了合作开发协议，协议总金额达3.5亿美元。
Atara由安进与风投公司凯鹏华盈于2012年联合创立，公司名字来自一位癌症患者。
Atara的技术来自纪念斯隆、凯特癌症研究中心，通过分裂健康志愿者的T细胞，进行扩增后用相应抗原处理活化T细胞，保存备用。使用的患者需要进行HLA匹配。
目前EBV-CTL、CMV-CTL处于二期临床研究阶段，WT1-CTL处于一期临床研究阶段。2015年2月，FDA授予EBV-CTL治疗利妥昔单抗难治性的EBV相关淋巴组织增生性疾病（EBV-PTLD）的突破疗法认定。
Bellicum的一项核心技术CID是给细胞疗法加入了一个“开关”，通过小分子rimiducid来控制信号通路的开关。该技术可以作为安全开关，rimiducid诱导细胞凋亡（当细胞疗法出现毒性时使用）；也可以作为活化开关，rimiducid诱导细胞更多的增殖（当细胞疗法作用不够强时使用）。细胞疗法一个很大的问题是个体差异大，剂量不好控制，有时候出现严重副作用，有时候又不够强起不到治疗效果，CID使得细胞疗法的应用更加灵活可控并且安全。
CID技术的实现途径：信号域使用特定的蛋白分子启动相应的信号转到途径。
安全开关：Caspase-9开关，Caspase-9是细胞凋亡的起始酶，通过活化Caspase-3等一系列信号转到，最终诱导细胞凋亡。
活化开关：MyD88/CD40开关，MyD88是一种应激反应信号蛋白，如在细胞因子、病毒侵袭时促使细胞通过活化or增殖应对刺激；CD40则是一种共刺激信号蛋白。MyD88、CD40的作用主要在树突细胞中研究较多，Bellicum则创新性应用到T细胞中。
CID技术可以应用到不同的细胞疗法：造血干细胞移植（HSCT）、CAR-T疗法、TCR-T疗法。Bellicum在此基础上开发了自己的TCR疗法技术CaspaCIDe和CAR-T疗法CIDeCAR、GoCAR-T。
Bellicum pipeline
CaspaCIDe
2016年8月4日，欧盟委员会授予BPX-501用于造血干细胞移植（HSCT）和激活剂rimiducid用于移植物抗宿主病（GVHD）治疗以孤儿药资格认定，今年早些时候，BPX-501和rimiducid以联合治疗获得美国食品药品管理局授予孤儿药地位。
CIDeCAR
GoCAR-T
蓝色小鸟是一家专注开发基因治疗药物的生物制药企业，2013年Bluebird与新基签订协议，合作开发CAR-T疗法。两家公司后来收紧合作范围，重点开发靶向BCMA的CAR-T疗法bb2121，适应症为多发性骨髓瘤，目前处于一期临床研究阶段。新基的核心产品正是治疗多发性骨髓瘤的来那度胺，2015年销售额58亿美元，BCMA则是多发性骨髓瘤最为热门的新靶点。新基将热门技术CAR-T与BCMA结合，布局也是颇为考究。
CytomX是一家抗体药物研发企业，其核心技术是Probody，通过融合一段多肽屏蔽抗体活性，linker则在肿瘤组织特异性的酶作用下断裂，释放有活性的抗体，提高抗体正常组织中靶产生的毒性。CytomX将该技术应用到CAR-NK技术中，建立了ProCAR-NK技术，相对于传统CAR-NK提高了病变组织特异性。
Eureka成立于2006年，是由华人科学家刘诚等创办的公司，总部位于美国加州湾区，目前在北京设有分公司优瑞科。
▲刘诚博士
Eukera的核心技术是开发针对细胞内靶点多肽（实际上是抗原处理后被MHC呈递到细胞表面的多肽）的抗体，即功能上类似于TCR的抗体。刘诚等还将该技术写进了springerlink 2015年出版的《Peptide Antibody》一书中，作为该书的第十七章：Generation of TCR-Like Antibodies Using Phage Display。Eukera与Juno等合作将该技术应用到CAR-T上，从而可以得到针对这些胞内靶标的CAR-T疗法。
Formula原来是一家研发癌症疫苗的企业，2014年转变方向到CAR-NK疗法研究，使用的是嵌合抗原受体的C.I.K细胞，即CIK-CAR技术。从捐献者获得C.I.K细胞，使用非病毒法基因改造。
iCell Gene开发常规的CAR-T疗法，此处不多做介绍，进展最快的项目为靶向CD4的ICG122，FDA已经授予治疗PTCL的孤儿药资格。
这两家公司的技术都来自安德森癌症研究中心，该CAR-T疗法采用了非病毒转染系统“睡美人”（sleeping beauty，简称SB）技术。
应用睡美人技术的CAR-T疗法在临床上表现除了更好的效果，PFS的OS成本增加。
ZioPharm Pipeline
Lion与NCI合作开发了TIL疗法技术平台，TIL来自于肿瘤组织分离的细胞，更适宜用于实体瘤的治疗，有其差异化优势。
Lion 围绕TIL疗法进行了升级：对TIL进行目的基因的改造，以求提高杀伤活性并寻求专利保护。Lion的lead产品LN-144处在二期临床研究阶段，适应症为黑色素瘤，Lion同时将TIL疗法与PD-1抗体等展开联合治疗的临床研究。
生产方面，Lion积极推进TIL疗法的商业化生产，并在2015年与药明康德达成协议，后者为Lion提供扩大的TIL产能。
Mustang Bio 成立于2015年，其细胞疗法与city of hope癌症研究中心合作开发，主持者为来自COH（city of hope）、针对CAR-T疗法做出开创性贡献的Stephen Forman 和Christine Brown博士。
▲左：Stephen Forman博士 右：Christine Brown博士
Mustang Bio旗下有两款CAR-T疗法已经进入一期临床研究，靶向IL13Rα2的MB101（适应症为难治性恶性胶质瘤）和靶向CD123的MB102（适应症为复发性急性粒细胞白血病AML）。
GBM同类产品竞争格局：
CD123靶点产品竞争格局：
2015年7月27日，NantKwest上市，首日涨幅超过40%，市值一度达到30亿美元，仅次于Juno，这个当时只有11名员工的细胞疗法研发企业进入人们视野，其创始人为华裔医生黄馨祥（黄馨祥收购ConKwest后改名）。正如企业新的名字暗示的那样，NantKwest的主要技术为CAR-NK疗法。
NantKwest的NK细胞经过改造不表达杀上抑制受体（KIR），可以避免肿瘤细胞等的免疫逃逸。基于独特的工程化NK细胞，NantKwest开发了抗体介导的高亲和力HaNK技术平台和靶向CAR-NK疗法taNK技术平台。
HaNK技术平台：抗体药物的靶向性来源于Fab与抗原的特异性结合，结合后通过ADCC、CDC等机制杀伤靶细胞。ADCC是许多传统抗体药物的重要作用机制，ADCC的一个重要途径为NK细胞的杀伤作用，通过受体CD16来介导。但一般情况下，人NK细胞的高亲和力CD16只占20%左右，多数NK细胞的CD16是低亲和力的，导致抗体药物的ADCC活性较弱。NantKwset对aNK细胞进行进一步改造，表达高亲和力的CD16。这样HaNK细胞疗法与抗体药物联用时，大大提高抗体药物的活性。
taNK：taNK即为基于工程化NK细胞的CAR-NK疗法，通过CAR达到靶向性NK细胞疗法的目的。NantKwest进展最快的taNK项目为靶向HER2的CAR-NK，另有多个taNK项目处于不同研发阶段。
Poseida从Transposagen拆分出来，后者与强生关于CAR-T疗法的合作也转移到Poseida。Poseida专注癌症、罕见病的基因疗法与CAR-T疗法的开发。Poseida拥有多项相关技术：piggyBacTM DNA Modification System, XTNTM TALEN和 NextGENTM CRISPR site-specific nucleases, 以及Footprint-FreeTM Gene Editing (FFGE)。
2015年12月，Poseida完成了A轮融资，目前商务产品进入临床研究。
Precision Biosciences是一家专注基因编辑技术的公司，拥有基于归槽内切酶的ARCUS基因编辑技术平台。2015年5月完成2560万美元A轮融资，2016年3月Baxalta与Precision达成协议，合作开发肿瘤免疫疗法CAR-T疗法。
Precision寻求开发基于异体T细胞的CAR-T off-the-shelf疗法，便于更方便的生产和使用。
Sorrento也是由黄馨祥创立的生物制药公司。Sorrento布局领域广泛：生物类似药、肿瘤免疫抗体、细胞疗法、ADC等，其中生物类似药主要与张江生物合作，细胞疗法方面在2016年6月与三生药业在国内成立合资公司，三生药业以1000万美元取得51%股权。CAR-NK细胞疗法则与NantKwest合作开发。
Sorrento子公司，专注细胞疗法。
Triumvira的技术来自加拿大麦克马斯特大学Jonathan Bramson博士的实验室，一种基于TAC技术平台的CAR-T疗法。
▲Jonathan Bramson博士
TAC的设计包含三部分：第一部分为胞外的抗原结合域（抗体片段或者DARPin等）、第二部分为胞外的anti-CD3 scFv、第三部分为跨膜的CD4 domain连接蛋白激酶LCK。总体设计更类似于TCR，受体改造的结果是对T细胞的激活保持在正常的范围。
基于TAC的CAR-T的生产与常规CAR-T类似。
TAC的优势：TAC受体的设计保留的TCR complex的功能，T细胞的激活与正常T细胞的激活是类似的，相当于加了一个阻尼，避免过度激活。
目前Triumvira 靶向CD19、BCMA的项目已经准备申报IND，另有多个项目处于前期研究阶段。
Unum开发了ACTR细胞疗法，该技术独具特色：靶向抗体药物而非抗原，需要与抗体药物联用。这有点类似于NantKwest的HaNK细胞疗法。2015年6月Unum完成6500万美元的B轮融资。
Vor Biopharma成立于2016年5月，由PureTech发起创立，核心技术CAR-T疗法来自哥伦比亚大学医学院助理教授Siddhartha Mukherjee的实验室，Siddhartha Mukherjee是著名科普书籍《众病之王：癌症传》的作者。
▲Siddhartha Mukherjee博士
Autolus是从伦敦大学学院剥离出来的生物技术公司，主要开发新一代CAR-T疗法，2016年3月完成4000万欧元的B轮融资。Autolus的CEO Christian Itin博士从事肿瘤免疫研究多年，任职Micromet CEO期间主持开发了双特异性抗体Blincyto（CD19*CD3），如今开发CAR-T疗法也是水到渠成的事。
Autolus旨在开发新一代CAR-T疗法，解决目前CAR-T疗法安全性问题以及更多肿瘤适应症的问题。
专注开发细胞疗法，是一家非营利机构，旨在成为联系工业界与学术界的转化桥梁。
Cell Medica的lead项目均为上一代细胞疗法（T-CelleratorTM），CAR-T、TCR-T疗法尚处在早期阶段。
Leucid Bio是从英国国王学院剥离出来的生物科技公司，开发的CAR-T疗法已经启动一期临床研究（NCT01818323），但目前仍未筹集到资金，仍处在和投资者谈判的过程中。
Oxford Biomedica拥有专利保护的LentiVector基因改造技术平台，基于此开发了多种基因疗法产品。Oxford Biomedica自己并不开发CAR-T疗法，但在2013年，诺华以1400万美元的代价换取Oxford Biomedica为其CTL019项目生产表达CTL019的LentiVector质粒。
Cellectis位于法国巴黎，成立于1999年，名副其实的老牌生物科技公司。Cellectis利用TALEN技术进行基因改造，采用异体T细胞的CAR-T疗法，先后与辉瑞、施维雅达成合作开发协议。2015年，启动UCART19项目的一期临床研究。在研项目还有靶向CD123、CD38、CD22的CAR-T疗法。
2015年11月，Cellectis完成UCART19项目的三批GMP生产，股票应声大涨20%。由于Cellectis采用异体T细胞，其CAR-T疗法更容易标准化和灵活应用给更广泛的患者人群。因此，顺利实现GMP生产意味着其产品离上市又近一步。
Celyad是一家比利时的制药企业，成立于2007年，2015年收购Oncyte获得NKR-2T细胞疗法，6月19日登陆纳斯达克。NKR-2 T细胞疗法能够识别多种肿瘤抗原，并使T细胞表达自然杀伤细胞受体NKG2D。当NKG2D与肿瘤表面配体结合时，就能杀死肿瘤细胞。Cylyad同时开发基于NKR-2T的自体/异体疗法，自体疗法已经进入一期临床研究阶段。
2015年4月，MolMed从San Raffaele Hospital收购靶向CD44V6的CAR-T疗法，CD44V6在血液癌症和一些实体瘤中均有表达，60%的AML和90%的MM表达CD44V6。
THERAVECTYS是巴斯德研究所(Pasteur Institute)衍生的一家私营、全面整合型发现与临床开发生物技术公司。公司发挥其在慢病毒载体领域超过15年的基础研究的优势，已获得巴斯德研究所知识产权的全球独家授权。THERAVECTYS在其慢病毒载体技术平台的基础上，开发了用于抗击癌症和感染性疾病的治疗性疫苗和免疫治疗药物，包括一种专利的区分性CAR T细胞技术平台。
BioNtech位于德国美因茨，专注MRNA药物、细胞疗法、基因疗法等，深耕肿瘤免疫领域。
Immatics是一家癌症疫苗研发企业，Pipeliner如下
Medigene是一家德国生物技术公司，成立于1994年。近年来开始开发T细胞疗法，相关Pipeliner如下
Bioatla是一家位于圣地亚哥的生物技术公司，开发了条件活化生物大分子（Conditonally Active Biologics）技术平台。这种技术得到的大分子如抗体只有在特定条件下（如肿瘤微环境的条件）才会活化，从而提高了安全性。
2015年4月，未名集团投资Bioatla成为其最大机构股东。2017年1月6日，Bioatla宣布与未名集团投资的另一家公司F1 Oncology合作开发基于CAB的CAR-T疗法，并计划在2017年启动首个实体瘤CAR-T临床试验。
此外还有TILT Biotherapeutics、Vira therapeutics等布局CAR-T、TCR-T疗法的企业，因公开信息有限，这里不再一一介绍。
免疫检点抑制剂、CAR-T疗法的兴起标志着医学已经发展到非常深入的地步，从化疗的“干预”回归到人体自身免疫系统的“平衡”，不得不慨叹免疫系统的复杂。多数疾病最终都归因于免疫系统的失衡，如何调节失衡的免疫系统以对抗疾病，已经在不知不觉中成为一种至关重要的手段。“金发姑娘原则”也好、阴阳调和理论也罢，本质上都是对免疫系统调节的一种哲学阐释，利用自身免疫系统以对抗疾病，将是一条没有终点但充满前景的发展之路。
目前CAR-T疗法动辄数十万美元的价格不是普通患者能够承受的，工业界仍需在标准化、控制成本等方面持续努力。中国企业将在这一过程中扮演重要角色，一方面有博生吉、西比曼等立足国内开发CAR-T疗法的公司，一方面有药明康德在全球CAR-T疗法中提供生产外包服务。中国市场的高度价格敏感性将促使企业不断谋求降低CAR-T疗法成本，最大限度提高药物可及性。
参考资料
Engineered T cells the promise and challenges of cancer immunotherapy(2016)；
CAR therapy= the CD19 paradigm(2016)；
CAR T-cell immunotherapy：The path from the by-road to the frreway(2016)；
CAR-modified T-cell therapy for cancer：an updated review(2016)；
Driving gene-engineered T cell immunotherapy of cancer(2016)；
PD-1 Blockade Modulates Chimeric Antigen Receptor (CAR) Modified T Cells and Induces Tumor Regression: Refueling the CAR。
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