Mol Cell背靠背 | HelR结合RNA聚合酶为病原菌提供利福霉素耐药性

原创望夜 BioArt

撰文 | 望夜

利福霉素（rifamycin）是一类天然产物来源的抗生素。第一代利福霉素B发现于1957年，来自地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）的发酵产物。目前治疗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染的一线药物利福平（rifampin/rifampicin），是利福霉素B的半合成衍生物，开发于上世纪60-70年代，可强效抑制细菌RNA聚合酶（RNAP）。细菌RNAP包含四种亚基α（两分子α）、β、β’、ω及一个瞬时结合的σ因子【1】，利福平结合β亚基（RpoB）占据转录本延伸路径【2】，阻止新合成的RNA通过，阻碍长度超过2-3 nt mRNA的产生。

随着抗生素的临床使用，病原菌的耐药性随之产生。利福霉素的一大缺点是耐药性产生频率高，达到约10^-7~10^-9/细菌/细胞【3】。研究显示，约95%的临床利福霉素耐药性突变发生在rpoB上一段81bp区域内【4】，特别是Asp516、His526、Ser531的突变可降低利福平对RNAP的亲和力，是结核菌耐药性突变的主要位点。环境中利福霉素耐药性的产生机制更加多样化，细菌会利用多种酶对利福霉素进行修饰失活，如磷酸化、ADP核糖基化、糖基化、羟基化。催化上述过程的酶通常都是利福霉素诱导表达的，且在其基因序列上游有一段19bp的回文序列【5】，称为利福霉素相关顺式作用元件（RAE），是诱导下游耐药酶表达必需的。尽管调节基因表达的分子机制尚不明确，但RAE可作为发现利福霉素耐药基因的重要指征。

已知的利福霉素失活机制均与RAE相关，但并非所有RAE下游基因都具备已知的耐药功能，例如，相当一部分RAE下游基因编码推测的解旋酶，称为利福霉素相关解旋酶样蛋白（HelR）。

2022年7月30日，加拿大McMaster大学的Gerard D. Wright研究组在Molecular Cell上发表了文章HelR is a helicase-like protein that protects RNA polymerase from rifamycin antibiotics，发现HelR可通过结合RNAP为委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）提供利福霉素耐药性。作者发现HelR可促进细菌对利福霉素的耐受性，与RNAP形成复合体，通过替换利福霉素解除其对转录的抑制作用。此外，作者还发现HelRs广泛存在于包括机会致病的分枝杆菌在内的放线菌门（Actinobacteria）中，成为阻碍新型利福霉素类抗生素开发的障碍。

同期Molecular Cell还背靠背发表美国Wadsworth中心Pallavi Ghosh研究组的文章Mycobacterium abscessus HelR interacts with RNA polymerase to confer intrinsic rifamycin resistance。该团队通过RNA-seq分析脓肿分枝杆菌（M. abscessus）在非致死剂量利福霉素和利福布汀（rifabutin）处理时的基因表达情况，发现Mab_helR表达上调25倍；敲除Mab_helR会对两种抗生素异常敏感；在结核分枝杆菌中过表达Mab_helR，可获得对利福霉素的耐受性。当细菌暴露于利福霉素环境时，HelR与RNAP结合增强，Mab_HelR可在体外介导RNAP与静止的转录起始复合物解聚。Mab_helR PCh-loop的顶端对其功能十分关键，但不影响复合体解聚，暗示HelR介导的利福平耐药性机制在RNAP解聚后还需要额外步骤。

具体来看，Wright组的文章从委内瑞拉链霉菌ATCC10712的RAE序列入手，发现其基因组共有两处RAE：其一与单加氧酶（Rox）有关，Rox是已知的利福霉素耐药酶；另一个与HelR相关。HelR_Sv类似超家族1解旋酶，但此前未发现该家族与抗生素耐药性有关。解旋酶属于单链DNA转位酶，可通过水解ATP沿DNA链双向移动，当遇到双链DNA时会将两条DNA链分开。解旋酶是DNA复制必需的，但不参与转录【6】。RNAP可结合启动子DNA形成转录泡，并在转录泡运动过程中打开下游DNA且无需解旋酶。但特定核酸片段的解旋如何影响利福霉素活性，及RAE如何控制该遗传过程目前仍不清楚。

作者发现HelR_Sv带有超家族1（SF1）解旋酶的一些典型基序，但缺失一个核心SF1解旋酶结构域，即UvdD样C末端结构域，是结合DNA所需的。不过HelR_Sv带有UvrD样ATP结合结构域，推测其功能应与利福霉素耐药性有关。

为验证上述推测，作者首先通过RT-qPCR验证helR和rox是利福霉素诱导表达的，当利福霉素存在时，两种蛋白的表达量分别升高50和15倍。接着，通过helR和rox敲除菌株证实，缺失helR时菌株对多种利福霉素的易感性升高8~16倍，且helR可提供比rox更强的耐药性；额外给予HelR表达质粒，可重建菌株的耐药性。作者还发现当ATPase活性被破坏时，敲除菌株无法重获耐药性，说明HelR的ATPase活性是利福霉素耐药性必需的。此外，作者还排除HelR是一种利福霉素失活酶的可能，说明以另外的机制提供耐药性。

随后，作者在进行圆片杀伤实验时发现当培养时间足够长时，helR⁺菌株最终可以在抑菌区域生长，推测HelR_Sv可提供某种利福霉素耐受性。使用时间杀菌实验分析在十倍量最小抑制浓度（MIC）利福霉素存在下委内瑞拉链霉菌的生长情况，发现HelR可提供对抗生素抑制浓度的耐受性，允许其存活更长时间。

那么HelR如何提供耐药性保护？文献报道与HelR_Sv有类似结构的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HelD可结合RNAP【7】，SF1解旋酶UvrD也可直接结合RNAP【8】。因此，作者推测HelR可结合RNAP，且应与利福霉素耐药性相关。为验证这一推测，作者纯化出委内瑞拉链霉菌的RNAP并利用液相色谱质谱（LS-MS）检测与其结合的蛋白，共检出76种高置信度的蛋白，发现当培养基中存在利福霉素时，差异蛋白中丰度最高的正是HelR_Sv。对纯化后的RNAP进行SDS-PAGE分析，可观察到对应HelR_Sv分子量的明显条带，质谱验证确为HelR。而反过来，使用带有C端Flag标签的HelR_Sv也可将RNAP共沉淀下来。由此证明，RNAP和HelR_Sv可在体内形成稳定复合物。作者进一步推测，HelR可能提供某种保护作用，阻止或逆转利福霉素结合RNAP。

近期报道过三种HelD与RNAP的结构，其中包括耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）HelD_Ms复合物结构【9】。分析发现HelD_Ms与RAE相关，是细胞暴露于利福平时丰度最高的蛋白，缺失该基因导致对利福平的易感性提高【10】，因此HelD_Ms事实上应该称为HelR_Ms。结构分析发现，HelR_Ms楔入RNAP的β’夹钳，削弱RNAP和DNA的互作，同时深入RNAP中。此外，HelD_Ms还带有一个结构上类似转录因子的辅助通道臂（SCA），及一个主要通道环（PCh），延伸到并占据活性位点。PCh-loop有三种构象，其中状态II的折叠会与活性位点形成互作，并十分接近RpoB上的利福平结构口袋，尽管不会与利福平发生冲突。因此，与作为RNAP保护蛋白的HelR_Sv相一致，HelR_Ms可将利福霉素从其靶位点去除。

接下来，作者验证HelR作为利福霉素保护蛋白的假设。使用纯化的RNAP、sigma因子σ^HerB、HelR_Sv及作为模板的合成启动子P_AP3在体外重建转录体系。通过加入过量HelR_Sv，证实其对转录本生成数量无明显影响，即无法促进转录发生，但HelR_Sv的加入可保护转录反应免受利福平的抑制。进一步地，作者还合成一种利福霉素光亲和探针（RPP），验证其具备利福霉素的所有抗生素特性。利用RPP可在体外纯化出RNAP，并观察到浓度依赖的RpoB标记；但当HelR_Sv存在时，被标记的RpoB减少，由此说明HelR_Sv可阻断或替换利福霉素。此外，作者还使用利福霉素ADP-核糖转移酶（Arr）处理RNAP结合的利福平。由于Arr仅能失活自由状态下的利福平，因此无法独立拯救结合着利福平的RNAP；但当HelR_Sv存在时，转录的抑制状态被解除，效果随HelR_Sv浓度升高而更加明显。上述结果说明，HelR_Sv可置换利福霉素的结合而保护RNAP。

最后，作者希望扩展发现更多的HelR类蛋白。使用HelR和前述与ARE相关的的HelD序列在公共数据库中检索，通过降低相似性阈值进行多轮检索后，最终获得1774条与RAE相关的HelD样蛋白序列，分布在29个聚类家族中，全部来自放线菌门（Actinobacteria）。经比较分析，作者确认HelR仅占HelD样酶的一小部分，其独特性就在于可提供利福霉素耐药性。

再看Ghosh组的文章。

她们选取的研究对象脓肿分枝杆菌（M. abscessus）是一种快速生长的非结核型分枝杆菌，是引起支气管-肺部感染、造成慢性肺损伤的重要病原【11】。该菌对现有抗生素敏感度极低，被称为“无法治愈的噩梦”【12】。脓肿分枝杆菌对利福平有天然耐药性，因为编码的ADP-核糖转移酶（Mab_arr）可核糖基化利福平，以阻止其结合RpoB【13】。此前研究发现，脓肿分枝杆菌暴露于利福平时，MAB_3189c表达升高25倍以上【14】，Ghosh组的研究也发现耻垢分枝杆菌暴露于利福平会上调MSMEG_2174 (Ms_helD) 的表达【15】，两种蛋白具备同源性。

在本文中，作者首先使用RNA-seq检测暴露在非致死剂量利福平中的Mab ATCC 19977菌株的基因表达情况，发现有6个基因上调表达4倍以上，其中变化最大的是Mab_arr和MAB_3189c，均超过25倍。序列比对显示MAB_3189c是HelD的同源蛋白，因其与利福平抗性有关，将其重命名为Mab_HelR。接着，作者发现在非致死剂量利福平存在时，8株临床分离株的Mab_HelR表达量均上调，说明Mab_HelR在利福霉素耐药性中发挥重要作用。

随后，作者发现敲除Mab_HelR的MabATCC菌株对利福霉素极度敏感，额外给予Mab_HelR的表达可重建耐药性。作者还发现Mab_helR和Mab_arr构成彼此独立且叠加的耐药机制，前者的表达不受后者影响。此外，在不含Mab_helR和Mab_arr同源基因且对利福平易感的M. tuberculosis H37Rv菌株中表达Mab_helR可提高对利福平的耐受性。由此说明，HelR可为分枝杆菌提供一种额外的利福平抗性机制，同时Mab_helR和Mab_arr为M. abscessus提供对利福布汀可诱导的基础耐药性。

接下来的研究思路类似前一篇：

首先，作者也注意到Mab_HelR上游RAE的存在，发现如果基因上游缺少RAE，利福平无法再诱导Mab_HelR的表达，说明RAE在利福平耐药基因诱导中发挥重要作用。

其次，作者同样关注到近期发表的HelD与RNAP的结构文章【9】，推测HelR与RNAP也存在相互作用。通过对纯化的RNAP复合体进行凝胶和质谱分析，确认MabHelR与其结合；反过来，纯化MabHelR时也能同时得到RNAP，由此说明两者在体内可稳定结合。此外，作者还验证MabHelR在体外可与Mtb_RNAP稳定结合，可部分恢复由于结合利福平造成的转录停滞。

第三，作者通过参照典型的HelD蛋白结构域组织形式，发现其4个保守结构域都可在MabHelR中找到，如形成用于结合和水解NTP的Rossman折叠。同时还发现MabHelR表现出明显的ATPase活性，且不依赖于RNAP结合。进一步利用突变体实验证实，ATPase酶活是MabHelR介导利福平耐药性必需的。此外，作者利用此前报道的MsHelR结构【9】模拟出MabHelR结构，并将其与MsHelR-RNAP复合物结构（PDB：6YYS）、M. smegmatis RNAP结合利福平的复合体结构（PDB：6CCV）对照分析，发现PCh-loop的尖端靠近利福平，突变体实验证实正是其上的关键氨基酸决定其耐药性。

最后，受此前报道的BsuHelD和MsHelR可解聚静止状态RNAP延伸复合体【7,9】的启发，作者推测MabHelR对RNAP复合体也有解聚效果。作者发现，当MabHelR预先结合RNAP时，RNAP-启动子DNA复合物的形成减少80%以上；而如果RNAP已经与DNA形成复合物，MabHelR的扰乱效果则大为减少。进一步发现，MabHelR可将因利福平存在而暂停的转录起始复合体从DNA上解聚下来，且这种解聚能力不依赖ATP，仅依靠PCh结构即可完成，尽管PCh本身不足以回补缺失菌株对利福平的易感性。作者由此认为，HelR介导的起始复合体解聚不足以赋予菌株利福平耐药性，可能还需要额外的步骤。

本次背靠背发表的两篇研究文章分别选取不同病原细菌，由不同实验方法入手，经过详细分析，最终均指向同一类解旋酶样蛋白HelR，发现其可为分枝杆菌提供利福霉素抗性，作用靶标是细菌转录过程的RNA聚合酶。环境微生物中的耐药组（resistome）是病原菌耐药性元件的来源，完整理解多样化的耐药机制有助于延长抗生素使用时间；同时，对耐药基因的深入研究也可以反过来助推新型抗菌药物的开发。从这个角度看，两篇文章的发表也有临床指导意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.019

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.034

制版人：十一

参考文献

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15. Hurst-Hess, K., et al. (2019). Mycobacterial SigA and SigB cotranscribe essential housekeeping genes during exponential growth. mBio 10. e00273–19.

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