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撰文 | 望夜
过氧化物酶体（peroxisome）是一类有膜结构的细胞器，广泛存在于大多数真核细胞中。过氧化物酶体中进行诸多关键代谢过程，如脂肪酸和其他生物分子的氧化【1】，上述过程会产生过氧化氢及其他活性氧成分，因此其内含有过氧化氢酶及其他参与维持氧化还原稳态的酶【2】。在人及其他动物中，过氧化物酶体还负责产生胆酸盐及髓鞘中的脂质【3】。过氧化物酶体异常会导致Zellweger综合征谱系等多种疾病，严重的甚至危及生命。过氧化物酶体中的多数酶是借助受体PEX5从胞浆中转运进入的，PEX5与过氧化物酶体膜上的锚定复合物结合。完成转运后，PEX5被膜上的泛素连接酶添加单个泛素（Ub）分子，随即再次回到胞浆中。PEX5在胞浆和过氧化物酶体中穿梭及其在腔体中释放货物的机制目前尚不明确。PEX5由一段长的、无规则结构、功能不明的N端区域及一个球形的三角形四肽重复结构域（TPR）构成。TPR结构域可与多数基质蛋白都含有的过氧化物酶体靶向信号（PTS）直接结合，如C末端的丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸（SKL）三肽组成的PTS1，或位于基质蛋白N端的PTS2，但PTS2的识别还需要接头蛋白PEX7。PEX5还存在一种短的可变剪接形式，仅能结合PTS1货物。PEX5结合货物后被过氧化物酶体表面的锚定复合物招募，该复合物由膜蛋白PEX13和PEX14组成【1】。体外实验显示，位于N端的保守芳香残基WxxxF/Y五肽基序介导PEX5与锚定复合物的结合【4】。但该基序介导的结合发生在过氧化物酶体的胞浆一侧表面还是后续步骤目前仍存在争议，现有证据是冲突的【5】。货物锚定后随即发生转运，该过程的细节是缺乏的，但折叠甚至寡聚的蛋白都可通过膜。为完成转运循环，PEX5必须回到胞浆中。再循环过程需要PEX5发生泛素化，由膜结合的RING-型泛素连接酶复合体催化，复合体由PEX2、PEX10、PEX12组成。PEX5的单泛素化罕见地发生在靠近N端的保守半胱氨酸上【6】。单泛素化的PEX5从过氧化物酶体中抽离被认为由一个六聚体AAA ATPase介导，后者由PEX1和PEX6组成。在胞浆中，Ub被去泛素化酶去除掉，以允许PEX5开启新一轮的货物转运。关于PEX5如何转运货物进入过氧化物酶体曾有几种模型：一种模型认为，PEX5会参与形成一个整合的转运通道；另一种模型认为，PEX5会在腔体和胞浆间穿梭运输货物。上述两种模型均有实验证据支持，但均无法解释货物如何在腔体中释放，因此PEX5介导蛋白转运进入过氧化物酶体的机制仍未被揭示。2022年8月4日，哈佛大学医学院的Michael L. Skowyra和Tom A. Rapoport在Molecular Cell杂志发表题为PEX5 translocation into and out of peroxisomes drives matrix protein import的研究论文，使用爪蟾卵提取物证实PEX5随货物一起完全进入过氧化物酶体腔内，并通过其靠近N端的WxxxF/Y基序结合膜锚定复合物的腔内结构域。PEX5的循环始于两亲螺旋结合泛素链接酶的腔体侧，随后单泛素化的N端回到胞浆中，最终PEX5被拉出腔体，出膜过程中发生去折叠从而促使货物释放。在本研究中，作者首先使用此前报道的爪蟾卵提取物系统【7】在体外重建货物蛋白进入过氧化物酶体酶体的过程。该系统可保持细胞器完整性并使胞内成分维持在接近生理浓度下，借助融合有荧光蛋白的PTS1观察蛋白运输过程。泛素活化酶抑制剂处理后，蛋白输入被严重抑制；同样地，消除提取物中的自由Ub，也会导致运输大大降低。作者随后尝试向去除泛素的提取物中补充Ub，可部分重建蛋白运输，但即便加入的Ub过量依然无法完全恢复，推测PEX5的含量限制转运水平。于是在给予Ub的同时额外加入PEX5，运输得以完全恢复，说明PEX5的泛素化是蛋白持续性运输进入过氧化物酶体必需的。随后，作者发现甲基化或缺失全部赖氨酸的Ub突变体均可重建蛋白转运，说明转运过程不依赖多聚泛素化。将PEX5上保守半胱氨酸突变为丙氨酸（C11A），运输无法重建；而当突变为赖氨酸（C11K）时，可保持完整活性。接着，作者使用PEX5不同突变体验证，只有第11位残基上的泛素化是转运必需的。此外，作者还使用Ub的不同突变体验证发现只有靠近C端的突变体抑制转运，说明单泛素化的PEX5上的Ub参与与循环机器（如Ub连接酶复合体）的互作，且发生在靠近膜表面的C端尾部。接下来，作者试图发现PEX5上的过氧化物酶体定位信号，前人研究提示应位于其N端的无序区域【8】。在人和动物中，该区域包含多个WxxxF/Y五肽基序（W1-W7）、类似的LXXXF基序（W0）及4段功能未知的两亲螺旋（AH1~AH4）。作者首先检测W0-W7的五肽基序，逐一对其进行单突变或组合突变，发现当上述五肽基序全部突变时，PEX5的转运活性被破坏；单独突变任一基序影响都不大，而同时突变N端前两个基序时会实质性降低转运活性，但其余下游基序的突变组合影响甚微。带有W0基序和N端WxxxF/Y基序的PEX5突变体仍具备一些转运活性。作者由此得出结论，PEX5的转运功能需要LxxxF基序及靠近N端的WxxxF/Y基序，而W5-W7是非必需的。作者还将每个螺旋上的保守氨基酸逐一突变为丙氨酸，发现前两个螺旋（AH1、AH2）是转运必需的，后两个螺旋（AH3、AH4）不影响转运。综上，PEX5向过氧化物酶体中转运货物依赖其无序区N端的两亲螺旋及五肽基序。随后，作者通过蔗糖非连续密度梯度离心将过氧化物酶体与胞浆分离，参与转运的PEX5与过氧化物酶体处于同一层，而未结合货物的处于胞浆层；向提取物中加入PEX5会增加过氧化物酶体结合的PEX5比例，并加速蛋白转运，表明转位位点通常并未达到饱和。缺少C11的PEX5突变体（如C11A）在过氧化物酶体中的积累量更高，这与该突变体失去返回胞浆的能力是吻合的；而当突变五肽基序时，过氧化物酶体中的结合部分急剧减少，特别是N端的五肽基序影响最为关键。因此，五肽基序是PEX5招募至过氧化物酶体必需的。需要指出的是，两亲螺旋AH1和AH2对靶向过氧化物酶体是非必需的，推测在后续的结合阶段发挥功能。此外，作者还利用蛋白酶切保护实验，证实膜锚定复合物上存在一个区段介导PEX5五肽基序与过氧化物酶体外表面的初始相互作用。PEX5会在结合后的某个时间点进入过氧化物酶体中，因为其五肽基序与PEX14的腔内结构域结合十分紧密。PEX5锚定后的下一步是否就是进入？作者继续通过蛋白酶切保护实验分析过氧化物酶体相关的PEX5。当向提取物中加入野生型PEX5时，约半数的过氧化物酶体结合的PEX5会被低浓度的蛋白酶K降解，可能说明PEX5结合在细胞器外表面；剩余的一半对酶有较强抵抗性，但在高浓度蛋白酶K处理时会转变为稍短的形式；当去垢剂存在时，所有Pex5均被降解。因此，在胞浆和过氧化物酶体间循环时，PEX5的一小部分暴露在胞浆中，此时蛋白的大部分都已经穿过细胞器膜，说明受体采取一种跨膜拓扑构象。类似结果在失去循环能力的C11A突变体上也可出现，即，随着突变体在过氧化物酶体中积累，截短形式的蛋白也增多。随后，作者在PEX5的N端或C端添加Flag标签后重复蛋白酶切保护实验，通过检测标签是否存在的方式确认PEX5的N端朝向胞浆。那么PEX5的N端是始终位于胞浆一侧还是先进入腔体再出来？作者在PEX5的N端中引入一个腔体蛋白酶的酶切位点，通过检测是否发生酶切来验证N端是否曾进入过氧化物酶体中。结果显示，PEX5的N端确实进入腔体中。随后确认，PEX5的N端通过过氧化物酶体腔体后再次回到胞浆中。进一步地，通过在PEX5蛋白不同位置融合过氧化物酶体中TYSND1酶切位点的方式，作者确认PEX5蛋白会整个进入过氧化物酶体的腔体中，随后经一个跨膜的中间态离开，中间态的N端位于胞浆中。接下来一个问题是，PEX5上的何种信号介导其离开过氧化物酶体腔？作者推测是前述两亲螺旋AH1和AH2。为验证这一推测，作者对两亲界面进行突变后再重复蛋白酶切保护实验，发现AH2突变体可被完全保护，说明其完全位于腔体中，应为PEX5的出腔信号；而AH1突变体仍被酶切截短，说明其N端已经回到胞浆中，类型的现象也在野生型PEX5和C11A突变体中观察到。因此，AH1和C11A突变体允许PEX5的N端回到胞浆，并可在后续步骤中被阻断。而跨膜外运中间体的形成需要PEX5 N端被截掉。当折叠结构域（Ub或SUMO）附加到PEX5 N末端时，融合蛋白的相当一部分会被完整保护而免受蛋白酶K的切割，且无截短形式的蛋白出现。因此，位于受体N末端的折叠结构域可阻断外运。那么失去外运功能的反向转运中间体的突变体是否与再循环机器（特别是Ub连接酶）互作呢？作者通过密度梯度离心分离过氧化物酶体结合的带有C端Flag标签的PEX5，将其溶解于去垢剂中，再使用Flag抗体将与PEX5互作的蛋白共沉淀下来进行质谱检测。作者发现：C11A突变体可沉淀Ub连接酶的全部三个组分（PEX2、PEX10、PEX12），及锚定复合物组分PEX14、PEX13；AH1突变体可沉淀连接酶复合体和锚定复合物组分；而AH2突变体无法沉淀Ub连接酶组分，但维持与锚定复合物的互作。因此，AH2螺旋是形成跨膜中间体必需的，此时PEX5的N末端在胞浆中，而C末端包括折叠的TPR结构域仍位于过氧化物酶体腔中。最后，作者希望确认PEX5离开过氧化物酶体的过程是否涉及C端TPR结构域的去折叠。作者将PEX5的TPR结构域替换为一个可结合GFP的纳米抗体，该突变体保留N端的转运和循环功能，但缺失过氧化物酶体靶向信号，检测发现GFP在腔体中累积，说明融合蛋白的纳米抗体在外运过程中发生去折叠，失去结合（并运输）GFP的能力。失去循环能力的C11A突变体与纳米抗体的融合蛋白则不会产生GFP积累，说明发生多轮GFP运输。在PEX5全长蛋白C端融合纳米抗体也可支持多轮GFP外运。综合上述结果，说明PEX5的TPR结构域在外运时发生去折叠，这可能就是PEX5运输的货物在腔体中释放的机制。回顾全文，作者通过详实的实验证据揭示PEX5摆渡蛋白进入过氧化物酶体的独特机制：运载蛋白货物的PEX5会整体进入过氧化物酶体，其进入信号在腔体中与锚定复合体的PEX14发生强相互作用。PEX5 N端的两亲螺旋通过结合膜上的泛素连接酶引发PEX5外运。PEX5再循环过程中，其TPR结构域发生去折叠使得货物在腔体中释放。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.07.004制版人：十一
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