环状RNA（circRNA）:新兴的治疗药物和疫苗

这两年来，circRNA凭借稳定性强、免疫原性低等诸多优点获得资本界的青睐。2021年2月，环状RNA领先企业Orna Therapeutics获8000万美元A轮融资，用于开发工程化环状RNA药物；Laronde分别于2021年5月10日与2021年8月30日完成5000万美元的A轮融资以及4.4亿美元的B轮融资；在国内，上海环码生物在2021年6月宣布完成千万美元级别的天使轮融资，旨在开发基于circRNA的创新疗法。2022年6月21日，北京圆因生物宣布完成超过2.8亿元人民币A轮融资利用circRNA技术开发新型疫苗及新型治疗领域。circRNA疗法已成为RNA领域新的吸金点，这标志着circRNA疗法已从幕后真正走向了前台。

circRNA是一类没有5’或3’末端的闭合RNA。很长时间内被认为是5’剪接点与上游3’剪接点的罕见和异常剪接的副产品。最近由于高通量RNA测序和生物信息学分析的快速发展，天然circRNA的大量生物学功能被揭示，从蛋白质和基因海绵、细胞活动调节剂到蛋白质翻译模板。此外，随着人们对天然circRNAs生理功能的认识不断加深，近年来，人们对开发circRNA合成技术和探索合成circRNAs在疾病治疗中的应用越来越感兴趣。到目前为止，合成的circRNAs不仅被用于治疗，例如替代治疗性蛋白质和多肽以及疫苗，也用作生物传感器。同时，为了在减少副作用的同时优化治疗效果，已经尝试了各种方法来合成circRNA。

虽然到目前为止，circRNA的生物发生机制仍不完全清楚，但天然的circRNA通常是由RNA反向剪接和规范的线性剪接形成的。只有一小部分circRNA来自一些哺乳动物细胞中的线性剪接，形成内含子circRNA。在内含子circRNA形成过程中，上游供体剪接位点与下游受体剪接位点联结，产生能够避免去分支的内含子 (图1A)。相比之下，大多数包含外显子的circRNA是由前体信使RNA反向剪接产生的。与正向剪接不同，后向剪接需要一个5’供体剪接位点连接到3’受体剪接位点，并在连接部位形成3’-5’磷酸二酯键以产生circRNA(图1B)。

图1. circRNA的生物发生过程

有效地合成circRNAs是理解circRNAs及其生物医学应用的基础。目前已经开发了许多化学方法和细胞内方法来合成circRNA。通常情况下，circRNA是通过合成一个或多个前体线性RNA，然后通过化学或酶连接介导的RNA环化来合成的(图2)。

图2. RNA环化方法的示意图

当包裹在脂质纳米粒(LNPs)中时，与体外和体内5-甲氧基尿苷(5moU)修饰的mRNA相比，没有核苷修饰的circRNA显示出与人促红细胞生成素(hEPO)相似的初始表达效率，并且表达持续时间更长(图3A)。最近，编码SARS-CoV-2 RBD抗原的circRNA也显示出比其线性对应的修饰线性RNA更高的翻译效率和更长的持续时间(图3B)。目前的RNA疫苗需要严格的储存和运输条件，而circRNA疫苗当被包裹在LNP中时，可以在4◦C下保存至少4周，在室温下保存约2周(图3C)。circRNA-LNPs疫苗的热稳定性比线形mRNA-LNPs疫苗好得多。外源circRNA的免疫原性可能是一把双刃剑。一方面，circRNA作为非疫苗蛋白替代治疗药物时，其免疫原性较低。例如，LNP-circRNA被证明可以逃避免疫传感器，并避免在RIG-I和Toll样受体(TLR)活性细胞和小鼠中引发免疫反应。但是，人们发现circRNA的免疫原性与其二级结构和circRNA的合成方法以及circRNA的剂量有关。总体而言，考虑到未经修饰的mRNA疗法过强的免疫原性可能抵消了这些RNA的蛋白质翻译效率，相对较低的天然免疫原性可能被证明是有价值的蛋白质/肽替代疗法。另一方面，外源基因具有诱导天然免疫应答的能力，为新冠肺炎疫苗mRNA1273、BNT162b2等免疫刺激基因疫苗的研制奠定了基础。

图3. 比较线性修饰mRNA和非修饰CircRNA的半衰期、可译性和稳定性

最近，从外来内含子产生的人工合成的circRNAs被证明能够刺激强大的免疫信号，并以依赖RIG-1的方式抑制病毒感染。circRNA的免疫原性也为将其用作自佐剂疫苗提供了可能性。例如，circRNA SARS-CoV-2疫苗可以诱导明显的IL-6和MCP-1的表达，这表明其激活了先天性免疫反应(图4A)。有意思的是，在增强免疫前恢复的IL-6和MCP-1水平以及监测到的稳定体温在一定程度上表明了这些circRNA疫苗的耐受性和安全性(图4B)。这些研究突出了合成蛋白质编码circRNAs作为疫苗和治疗药物的巨大潜力。

图4. circRNA疫苗激活了先天性免疫反应并具有良好的安全性

circRNA是RNA家族中又一颗冉冉升起的新星。近年来高通量RNA-seq技术的发展揭示了circRNA的各种功能，激发了人们探索内源性circRNA作为疾病生物标志物的兴趣，并开发合成circRNA作为治疗药物和疫苗。利用一些化学和酶合成策略，circRNAs已经被合成为蛋白质编码或非编码疗法和疫苗。然而，circRNA合成方法仍存在一些局限性，如环化效率低、酶等试剂成本高等。预计，在未来几年内，可以开发先进的circRNA合成技术，以促进circRNA的发展。总之，尽管天然circRNA的功能和合成的circRNA生物学仍有待了解，但目前circRNA作为一类新兴的RNA治疗药物和疫苗已初露锋芒。

参考文献

1.Circular RNA: An emerging frontier in RNA therapeutic targets, RNA therapeutics, and mRNA vaccines.

2.Advances in Circular RNA and Its Applications.

3.Recent research progress on circular RNAs: Biogenesis, properties, functions, and therapeutic potential.