慢性淋巴白血病靶蛋白“自杀”，对抗新一代抑制剂 | NEJM论文提示魔高一尺，道如何高一丈

王侃侃†，张建明†‡

†上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所，医学基因组学国家重点实验室；‡上海交通大学医学院附属瑞金医院国家转化医学中心（上海）

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是参与B细胞抗原受体（BCR）信号通路的关键激酶，与B细胞恶性肿瘤的发生发展密切相关。自2007年伊布替尼（ibrutinib）问世以来，BTK抑制剂已彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗模式。尤其在初治慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中，包括伊布替尼、acalabrutinib、zanubrutinib在内的几种共价BTK抑制剂显示出了高缓解率和持久疗效，开启了CLL治疗的“无化疗”新时代。

尽管共价BTK抑制剂表现良好，但由原发或获得性耐药导致的疾病进展或复发仍不可避免。从分子机制看，耐药的成因不外乎靶点突变，靶蛋白介导的信号通路重组以及肿瘤细胞内遗传和代谢的重编程等因素。共价BTK抑制剂均通过与BTK激酶结构域的C481结合形成共价键，阻断BTK催化活性来发挥临床作用。前期研究显示，出现BTK抑制剂耐药的CLL患者大多存在BTK C481抗性突变，BTK抑制剂失去结合位点，大大减弱了抑制效力，从而引起耐药。此外，BCR信号通路下游PLCγ2的功能获得型突变也是BTK抑制剂耐药的常见机制。

近年应运而生的可逆、非共价BTK抑制剂则为B细胞恶性肿瘤患者提供了一种新选择。包括pirtobrutinib（LOXO-305）、ARQ-531、fenebrutinib在内的非共价抑制剂并不依赖于和C481位点形成共价键，既适用于未接受过共价抑制剂治疗的患者，以降低获得性耐药风险，也对因C481突变而对共价BTK抑制剂耐药的患者有效。

在迄今为止的1/2期临床研究中，非共价BTK抑制剂在治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤方面显示出较强特异性和良好耐受性，非共价抑制剂与维奈克拉、PI3K抑制剂等其他新型药物的联用更展现出优于单药治疗活性的潜力。相较于其他几类药物，目前针对非共价BTK抑制剂耐药机制的探索几乎空白，越来越多的多重耐药难治患者亟需新的解决方案来进一步改善预后。因此从基因组学角度更为全面、系统地解析非共价BTK抑制剂的耐药机制，有助于提前寻找克服耐药的新策略。

2022年2月24日，美国西尔维斯特综合癌症中心（Sylvester Comprehensive Cancer Center）Justin Taylor教授和纪念斯隆•凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）Abdel-Wahab教授课题组在《新英格兰医学杂志》（NEJM）联合发表论文，对非共价BTK抑制剂的耐药机制进行了较为深入的探索[1]。

该研究包括的9名患者来自针对难治/复发B细胞恶性肿瘤患者的一项多中心1/2期BRUIN试验，这9名复发/难治性CLL患者患者接受过pirtobrutinib治疗并产生获得性耐药。研究者利用靶向基因组测序、单细胞测序、CITE-seq、结构建模等，对患者治疗前和疾病进展时的标本进行了比对分析。

通过靶向测序，作者发现7名患者在接受pirtobrutinib治疗中获得了非BTK C481位点突变（V416L、A428D、M437R、L528W和T474I）。有趣的是，这些突变位点均分布于BTK的激酶ATP结合口袋中。前蛋白晶体结构研究表明，这些位点皆参与了和化合物的结合。另2名患者则表现为治疗前后PLCγ2的持续突变。这些新突变的获得致使患者对非共价BTK抑制剂以及某些共价BTK抑制剂产生耐药。为了探索pirtobrutinib耐药的克隆演化，作者借助单细胞技术对患者两个时间点的突变谱进行比对，发现治疗前只有PLCγ2突变的患者3新出现了BTK L528W位点的突变，而患者4在pirtobrutinib显著抑制C481S突变克隆后又获得了L528W位点的新突变。

作者随后对非C481 BTK突变体进行了功能验证。通过体外实验证实表达BTK新突变体（V416L、A428D、M437R、L528W和T474I）的细胞对非共价BTK抑制剂的敏感性降低（IC50值↑）。此外，BTK非C481位点的新突变使得BTK蛋白与非共价BTK抑制剂的结合亲和力降低（KD值↑），以及与共价BTK抑制剂的结合效力降低（Kinact/KI值↓）。同时，信号传递通路分析显示，BTK新突变（V416L、A428D、M437R和L528W）降低了BTK蛋白Y223位点的自身磷酸化水平和PLCγ2 Y1217位点的磷酸化水平，从而导致了BTK激酶活性的下降。

对携带BTK突变的细胞给予IgM刺激，发现失活的BTK突变体仍会激活蛋白激酶B（Akt）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和核因子κB（NF-κB），以及钙离子内流增加。以上结果表明，BTK突变体仍能持续激活下游信号通路，出现BTK突变导致的继发性耐药。最后，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和CITE-seq技术结合生物信息学，作者比较分析了pirtobrutinib治疗后复发患者与pirtobrutinib治疗敏感患者的单细胞转录组图谱，发现对pirtobrutinib耐药患者体内存在BCR信号通路的持续激活。

该研究的亮点在于较为系统地研究了对pirtobrutinib耐药的CLL患者中广泛存在BTK非C481位点突变以及下游的PLCγ2突变，并证明了BTK突变体虽然丧失了激酶活性但仍会导致BCR信号通路的激活和Akt激活。这一发现将有助于更好地理解非共价BTK抑制剂耐药的新机制，也为进一步制定克服BTK抑制剂耐药的策略提供新的理论依据，如联合抑制BTK和Akt可能是克服耐药的一种有效策略。

在靶向药物的研发方面，目前仅有20%的蛋白能用小分子或大分子药物调控，高达80%的蛋白无法被现有药物调控。由于小分子和抗体药物均需要持续占据靶蛋白活性位点以阻断其功能，因此需要达到足够高的浓度方可发挥作用，这种作用机制不可避免带来耐药性或不可成药等问题。该研究的体外细胞药敏实验的结果也显示，目前临床使用的BTK抑制剂，不能克服所有的BTK耐药突变。这提示基于PROTAC（蛋白水解-靶向嵌合体）技术也许将来在治疗耐药性CLL上有较大的临床应用前景。

在CLL的整体治疗策略上，作者初步探讨了肿瘤异质性是肿瘤细胞产生耐药的根源这一科学问题。不同于其他的致癌蛋白激酶，如黑色素瘤中的BRAF V600E，慢性髓系细胞白血病（CML）中的BCR-ABL以及肺癌中的EGFR皆因突变激活而致癌，在B细胞肿瘤中尚未有BTK激活突变的报道。然而，在各种B细胞淋巴瘤中，BCR信号传导似乎有慢性增加。许多淋巴瘤通过响应肿瘤微环境中的外来或自身抗原来维持B细胞受体信号；大量证据支持与自身抗原相互作用而驱动的B细胞增殖对这些疾病的发生至关重要。因此在BTK抑制剂的选择压力下，CLL肿瘤细胞易于演化多重逃逸机制而产生临床耐药。

受限于样本容量，该研究只分析了复发早期且先前曾接受共价BTK抑制剂治疗患者的基因特性。未来的研究可以扩大样本量，进一步评估复发晚期以及早期未接受共价BTK抑制剂患者体内是否存在类似的耐药机制。

参考文献