EMBO Rep｜康九红课题组发现lncRNA SOX1-OT调控人ESC神经元发生的新机制

撰文︱康九红

责编︱王思珍

长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200nt且不编码蛋白的RNA分子，研究显示lncRNA能够通过调控基因转录、作为信号分子、蛋白质复合物支架、分子诱饵等方式实现其生物学功能，并参与调控多种生物学过程[1]。lncRNAs广泛存在于神经系统中[2]，近年来的一些研究揭示了部分lncRNA在神经系统中的调控作用。然而，仍有相当数量的神经系统中高表达的lncRNAs，其功能尚不明确。

人胚胎干细胞（ESC）具有分化成包括神经在内的多种组织细胞的能力，并且其分化过程在相当程度上与体内发育相类似，是体外研究人类发育过程和模拟疾病发生的良好模型[3]。近来发展的利用人PSC的3D培养方法建立脑部类器官—“类脑体”则能分化产生规则排列的神经前体细胞和放射状胶质细胞，并能够形成类似脑室的空泡，其进一步接近于大脑本身的构造，具有与体内极其类似的神经发育过程，是利用干细胞研究脑发育等非常好的系统[4]。

SOXB1家族转录因子，主要包括SOX1、SOX2和SOX3，在神经系统发育过程中起到重要的调控作用。研究显示，SOXB1家族在神经前体细胞中高表达，在小鼠胚胎瘤细胞中过表达SOX1能够起始细胞向神经方向分化[5]；在端脑来源的神经前体细胞中过表达SOX1能够明显促进向TUBB3阳性神经元的分化[6]。然而，在神经分化过程中，SOX1如何调控神经元分化以及SOX1的表达受到哪些分子调控，尚不明确。

2021年12月20日，同济大学的康九红团队在EMBO Reports杂志上发表了题为“LncRNA SOX1-OT V1 acts as a decoy of HDAC10 to promote SOX1-dependent hESC neuronal differentiation”的研究论文，研究了一条跨越SOX1的lncRNA SOX1-OT在人ES神经元发生过程中调控作用及其机制。奚佳捷副教授、徐焱鑫博士和郭贞明博士为本文的共同第一作者，康九红教授为本文的通讯作者。

该研究首先构建了人ESC神经分化系统。发现随着神经分化的起始，早期神经分化相关转录因子，诸如PAX6、SOX1表达上升，继而在分化第23天，这些细胞表达大脑皮层相关转录因子TBR1/TBR2；而在神经分化的第10天加入腹侧化因子SAG可将ESC往内侧神经节隆起（MGE）方向分化，PAX6随着腹侧分化的进行表达下降，腹侧化Nkx2.1和Nkx2.2表达上升。SOX1-OT是一个跨越转录因子SOX1的lncRNA，在皮层分化和MGE分化过程中皆上调表达。接着，通过在SOX1-OT转录起始位置插入连续3个PolyA转录终止信号，我们建立了抑制SOX1-OT表达的人ES细胞系（SOX1-OT-PAKI），并且诱导该细胞分别向大脑皮层和MGE方向分化。发现，在神经分化起始阶段，抑制SOX1-OT并不会影响早期神经转录因子PAX6的表达。继而在向皮层分化过程中，抑制SOX1-OT引起SOX1阳性细胞数量都会减少，虽不影响TBR2阳性细胞的数量，但TUBB3阳性皮层神经元的数目明显减少。在腹侧MGE分化中，抑制SOX1-OT同样会导致SOX1阳性细胞数量都会减少，虽不影响NKX2.1阳性细胞的分化产生，但NKX2.1阳性细胞却不能进一步分化成为GABA阳性神经元。这些结果表明抑制SOX1-OT虽然不影响hESC向神经上皮细胞和区域化的神经祖细胞分化，但会显著地抑制神经元的形成（图1）。

图1 抑制SOX1-OT显著地抑制神经元的形成

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

为了研究SOX1-OT调控SOX1的机制，作者观察了抑制SOX1-OT对于SOX1基因组区域组蛋白修饰的变化。ChIP结果显示抑制SOX1-OT不影响SOX1基因组区域H3K4me3和H3K27me3的水平，但会显著下调H3K14和H3K27的乙酰化水平。HDAC是重要的去乙酰化酶，作者尝试HDAC的抑制剂是否能够挽救抑制SOX1-OT所导致的神经元分化缺陷。在SOX1-OT-PAKI分化8-16天，HDAC抑制剂24781也有类似的效果，能够显著增加SOX1阳性细胞（16天）、SOX1基因组区域的H3K14和H3K27乙酰化水平（16天）和神经元的数目（32天），显示SOX1-OT可能通过调节组蛋白乙酰化修饰导致神经元分化缺陷。由于24781是一个广谱的HDAC抑制剂，其可以抑制HDAC1、2、3、6、8、10而发挥作用，因此作者进一步检测了在SOX1-OT抑制细胞系中，抑制哪一个HDAC能够挽回SOX1的表达下调以及神经元的分化缺陷。作者利用一个HDAC的抑制剂组合，包括了2833（抑制HDAC1、3）、CAY（抑制HDAC2）、34051（抑制HDAC8）和BUF（抑制HDAC6、10），发现在分化8-16天加入抑制剂组合能够显著上升SOX1阳性细胞的数量。进而作者发现在抑制剂组合中撤走BUF不能挽救因抑制SOX1-OT而导致的SOX1阳性细胞数减少，而撤走其他抑制剂则没有影响。同时发现，在分化8-16天仅加入BUF，即能够挽回抑制SOX1-OT所导致的SOX1的表达下调、SOX1基因组区域的H3K14和H3K27乙酰化水平降低，以及相关神经元分化缺陷。在腹侧分化中也得到了相类似的结果。这些结果表明HDAC6和10参与了SOX1-OT对于神经分化调控（图2）。

图2 SOX1-OT调控SOX1基因组区域H3K14和H3K27的乙酰化水平

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

在此基础上，作者进行了RNA pulldown实验，结果显示SOX1-OT能够与HDAC10结合而不与HDAC6结合，ChIP实验也显示在抑制SOX1-OT后，HDAC10在SOX1区域结合上升，提示SOX1-OT通过与HDAC10结合调控了SOX1基因区域的乙酰化修饰和SOX1的表达。进一步的RNA pulldown实验显示SOX1-OT的5’端能够与HDAC10结合，而其3’端则不能。在皮层分化还是在MGE分化中，过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能回复SOX1阳性细胞的数量，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。同样，过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能恢复SOX1基因区域的H3K14和H3K27的乙酰化水平，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。并且过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能阻止HDAC10在SOX1基因区域的结合，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。这些结果进一步确证了SOX1-OT和HDAC10之间的相互作用，以及这种相互作用在阻止HDAC10与SOX1基因区域结合进而调节神经分化中的关键作用（图3）。

图3 SOX1-OT 5’端与HDAC10结合阻止HDAC10在SOX1基因组区域结合

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

原神经基因（proneural gene）ASCL1、NGN1和NGN2等在神经元发生中具有关键的作用。为了探究SOX1-OT和SOX1调节神经分化的下游靶分子，作者检测了这些原神经基因的表达。实验发现，在抑制SOX1-OT后，ASCL1的表达显著下调，而NGN1和NGN2的表达没有变化。进一步研究发现，神经分化过程中在SOX1-OT PAKI中过表达SOX1能够激活ASCL1的表达。并且不论在皮层分化，还是在MEG分化中，SOX1皆能结合到ASCL1的启动子区域。接着作者在SOX1-OT PAKI细胞系中建立了可诱导表达ASCL1的细胞系SOX1-OT PAKI ptASCL1，并分别往皮层和MGE分化。结果显示，无论是在皮层分化，还是在MGE分化中，过表达ASCL1皆能够挽救因抑制SOX1-OT所导致的神经元分化缺陷。进一步证实了ASCL1是SOX1-OT/SOX1介导神经分化的重要靶分子（图4）。

图4 ASCL1介导了SOX1-OT/SOX1调控神经元的分化

（图源：Xi,et al., EMBO Rep, 2021）

图5 SOX1-OT作用模式图

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

原文链接：https://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embr.202153015

该工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委等项目的支持。

通讯作者康九红教授

（照片提供自康九红实验室）