Cell: CAR T细胞功能障碍中向NK类CAR T细胞的转变 | Cell Press论文速递

原创 Cell Press CellPress细胞科学

生命科学

Life science

近日，美国宾夕法尼亚大学Pelelman医学院细胞免疫治疗中心等的研究人员揭示了人类CAR T细胞的可塑性，并证明ID3和SOX4表达的基因下调可以通过预防或延迟CAR T细胞功能障碍来提高实体瘤CAR T细胞治疗的疗效。相关成果12月2日发表于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上。

▲长按图片识别二维码阅读原文

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗在血液恶性肿瘤中取得了显著的成功，但在治疗实体瘤时效果欠佳，其中一个原因是CAR T细胞在实体瘤微环境中耗竭（exhausted）。在胰腺癌中，为了研究间皮素重定向（mesothelin-redirected）CAR T细胞的功能障碍，我们建立了一个强大的连续抗原暴露模型，再现了T细胞耗竭的标志特征。而且，我们通过体外实验和CAR T细胞患者研究发现，CAR调控障碍与CD8+ T到NK样T细胞的转变有关。此外，我们确定了定义CAR和TCR调控障碍的基因特征和转录因子，包括CAR T细胞耗竭的关键调节因子——SOX4和ID3。我们的研究结果阐明了人类CAR T细胞的可塑性，并证明了ID3和SOX4表达的遗传性下调可以防止或延缓CAR T细胞的功能障碍，从而有助于提高CAR T细胞治疗实体瘤的疗效。

引言

“T细胞耗竭”（exhaustion）是T细胞在慢性病毒感染或对肿瘤的反应中受到持续的抗原刺激时获得的一种分化状态^[1]。如果抗原未能完全清除，则感染或肿瘤会导致T细胞的效应功能逐渐丧失或调节失调^[2]。T细胞耗竭的标志包括：效应功能降低、独特的表观遗传和转录基因特征、多种抑制性受体持续表达、细胞因子产生缺陷、趋化因子表达增加，以及增殖能力受限^[3][4][5] 。既往研究分析了来自患者的耗竭的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）^[6][7][8][9]和来自小鼠模型的TILs^[10][11]，发现了上调的基因，确定了抑制肿瘤免疫的基因，包括LAYN、Tox和Gata3。此外，在小鼠和人类CD8+T细胞中进行的全基因组CRISPR-Cas9敲除和敲入筛查发现了更多的靶点，包括Mapk14, Dhx37, NR4A, ZC3H12A, Ptpn2, SOSCS1和TGFBR2，这些基因可以调节T细胞功能^{[12][13][14][15][16][17][18]}。值得注意的是，在体内模型中，经过基因工程改造的CAR T细胞和T细胞受体（TCR）T细胞进入肿瘤微环境（TME）时也会获得耗竭的表型^[19][20][21]，因此，科学家们提出了一种假设：CAR T细胞耗竭/功能障碍是CAR T细胞治疗的主要障碍^{[22][23][24][25]}。

我们假设，开发一种体外CAR T细胞模型，采用长期持续的抗原暴露来驱动CAR T细胞耗竭或功能障碍，将有助于发现CAR T细胞功能障碍的全新观点。与体内模型相比，体外模型具有可扩展性，易于操控，有利于研究T细胞功能障碍在多个时间点的动态变化。尽管CAR T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得了巨大的成功，但实体瘤患者对CAR T细胞疗法的反应并非全都是治愈性的。因此，我们专注于实体瘤，特别是胰腺癌，使用胰腺细胞来刺激间皮素导向的CAR（M5CAR）T细胞。目前，相关的1期研究正在进行中，以评估静脉输注M5CAR T细胞在间皮素阳性肿瘤患者中的安全性和可行性（NCT03054298，NCT03323944）。考虑到现在的CRISPR-Cas9技术可以让科研人员对人类T细胞进行安全的多重基因编辑[26]，可用于发现CAR T细胞中的耗竭诱因，因此原则上可以通过诱因的失活来开发合成增强的CAR T细胞疗法，从而实现治疗实体瘤的目标。

在此，我们开发并验证了一个CAR T细胞功能障碍的体外模型，它不仅再现了T细胞耗竭的独特特征，还确定了以前未知的CAR T细胞功能障碍标志——转录因子的表达以及传统CD8+ T细胞向NK样T细胞的转换过渡。在CAR T临床试验的患者样本中，表面CAR的丢失和NK样CAR T细胞的存在进一步突出了这些T细胞功能障碍标志的相关性。我们还利用这一体外模型来确定功能障碍的基因特征，并揭示了ID3和SOX4转录因子可以增强这种基因特征，从而引起CAR T细胞毒性减弱。值得注意的是，这种细胞毒性的减弱可以通过破坏ID3或SOX4而弱化，这揭示了一种潜在的策略，可用于提高CAR T细胞治疗实体瘤的疗效。

讨论

最近的一些研究表明，T细胞功能障碍是实体瘤中CAR T细胞治疗无效的主要原因^[27]。然而，人们对介导CAR T细胞功能丧失的机制知之甚少。在此，我们在体外模型中探究了肿瘤抗原（CAE）的长期暴露如何影响CAR T细胞的疗效、表面表达和表型，就像CAR T细胞在肿瘤微环境（TME）中遇到的情况一样。我们展示了CAR T功能障碍或耗竭基因特征的获得，以及调节这一转变的转录因子。此外，我们还确定了CAR T功能障碍的多种机制，并证明了这些机制有利于为接受CAR T细胞治疗的患者提供帮助。

在本研究中，我们发现了CAR T细胞功能障碍的机制，即细胞经历从T细胞到NK样T细胞的转变。除了NK受体之外，我们的体外模型中的CAR T细胞还表达了所有三种具有细胞毒性的颗粒蛋白基因。既往研究也表明了CTLs对NK样细胞的可塑性（Meresse et al., 2004）。总之，这些数据支持NK样T细胞在免疫过程中发挥重要作用，并且T细胞可以经历向NK样T细胞的过渡。在长效CAE下，CAR T细胞无法重新表达表面CAR，而且参与抗原呈递途径的基因表达也显著降低（见图2C）。由于NK受体能够提供T细胞存活所需的信号，因此我们推测，上述条件可能导致了CAR T细胞向NK样T细胞的过渡转换。抑制性NK受体的表达，如CD94-NKG2A，KLRB1（CD161）等，可以抑制过度的刺激信号传导，从而避免由TCR或CAR激活而诱导的细胞死亡。

通过分析肿瘤抗原（CAE）CAR转导的CD8+ T细胞的单细胞基因表达数据，我们发现了非功能障碍和功能障碍的细胞亚群。功能失调的T细胞亚群由一组强大的基因表达特征定义，包括与T细胞耗竭有关的基因，如HAVCR2^[28][29]、LAYN^[30]、PHLDA1^[31]和TNFRSF9^[32]，以及与功能失调没有已知联系的基因，包括RGS16、SRGAP3、DUSP4、NDFIP2和CD9。

CAR的表达主要是在功能障碍的T细胞亚群中检测到的，而在非功能障碍的T细胞亚群中表达极少，这表明CAR T细胞的慢性激活可以驱动功能障碍的表型。令人惊讶的是，我们观察到，在体外CAR T CAE模型中发现的功能障碍基因特征与从体内肿瘤中分离出来的功能低下的NY-ESO-1 TILs的基因表达变化有很强的一致性；这种重要的相关性表明，本研究揭示的功能障碍特征与基因工程细胞治疗有关，而与CAR-或TCR的介导无关。此外，具有复发性间皮素阳性AsPC-1肿瘤的小鼠在输注M5CAR T细胞后，体内功能低下的TILs也表达了NK受体和细胞耗竭的标志物，与我们在图4A中的体外试验数据相似。这些数据共同证明了，具有耗竭特征的细胞在体内也是功能失调的。

我们进一步研究了驱动CAR T细胞功能障碍的调节机制，并发现转录因子SOX4和ID3可以调节功能障碍特征中的基因。值得注意的是，我们发现在ID3和SOX4 敲除的人类CAR T细胞中，CAR T细胞的杀伤力有所提高，这表明这些转录因子在CAR T细胞功能障碍中的重要作用。此外，ID3和SOX4也是记忆CD8+ T细胞发育的关键转录因子，而Prdm1和Id3的表达可以用于区分急性病毒和细菌感染与肿瘤中不同的CD8+T细胞亚群^[33]。

总之，我们强大的胰腺癌功能障碍体外模型揭示了CAR和TCR T细胞功能障碍的多种机制，包括CD8+T细胞的耗竭和过渡到NK样T细胞状态的特征。值得注意的是，我们证明这些体外试验的观察结果与体内的生理过程高度相关——无论是在CAR T和TCR功能障碍的小鼠模型中，还是在CAR T细胞输注后的患者身上。我们进一步证实了该模型的预测价值，即CAR T细胞中转录因子ID3和SOX4的破坏会降低功能失调的基因表达特征，而且更重要的是，会增强肿瘤的杀伤力。总之，本研究中针对人类T细胞功能障碍的体外模型提供了一个可供验证的平台，有利于开发新的策略，以提高CAR和TCR T细胞治疗实体瘤的疗效。

参考文献

[1] Blank, C.U., Haining, W.N., Held, W., Hogan, P.G., Kallies, A., Lugli, E., Lynn, R.C., Philip, M., Rao, A., Restifo, N.P., et al. (2019).Defining ‘T cell exhaustion’. Nat. Rev. Immunol. 19, 665–674.

[2] Pauken, K.E., and Wherry, E.J. (2015). Overcoming T cell exhaustion in infection and cancer. Trends Immunol. 36, 265–276.

[3] Blank, C.U., Haining, W.N., Held, W., Hogan, P.G., Kallies, A., Lugli, E., Lynn, R.C., Philip, M., Rao, A., Restifo, N.P., et al. (2019). Defining ‘T cell exhaustion’. Nat. Rev. Immunol. 19, 665–674.

[4] Pauken, K.E., and Wherry, E.J. (2015). Overcoming T cell exhaustion in infection and cancer. Trends Immunol. 36, 265–276.

[5] Thommen, D.S., and Schumacher, T.N. (2018). T Cell Dysfunction in Cancer. Cancer Cell 33, 547–562.

[6] Li, H., van der Leun, A.M., Yofe, I., Lubling, Y., Gelbard-Solodkin, D., van Akkooi, A.C.J., van den Braber, M., Rozeman, E.A., Haanen, J., Blank, C.U., et al. (2019). Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma. Cell 176, 775–789.e718.

[7] Guo, X., Zhang, Y., Zheng, L., Zheng, C., Song, J., Zhang, Q., Kang, B., Liu, Z., Jin, L., Xing, R., et al. (2018). Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing. Nat. Med. 24, 978–985.

[8] Zhang, L., Yu, X., Zheng, L., Zhang, Y., Li, Y., Fang, Q., Gao, R., Kang, B., Zhang, Q., Huang, J.Y., et al. (2018). Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer. Nature 564, 268–272.

[9] Zheng, C., Zheng, L., Yoo, J.K., Guo, H., Zhang, Y., Guo, X., Kang, B., Hu, R., Huang, J.Y., Zhang, Q., et al. (2017). Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169, 1342–1356.e1316.

[10] Singer, M., Wang, C., Cong, L., Marjanovic, N.D., Kowalczyk, M.S., Zhang, H., Nyman, J., Sakuishi, K., Kurtulus, S., Gennert, D., et al. (2016). A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells. Cell 166, 1500–1511.e1509.

[11] Khan, O., Giles, J.R., McDonald, S., Manne, S., Ngiow, S.F., Patel, K.P., Werner, M.T., Huang, A.C., Alexander, K.A., Wu, J.E., et al. (2019). TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature 571, 211–218.

[12] Dong, M.B., Wang, G., Chow, R.D., Ye, L., Zhu, L., Dai, X., Park, J.J., Kim, H.R., Errami, Y., Guzman, C.D., et al. (2019). Systematic Immunotherapy Target Dis- covery Using Genome-Scale In Vivo CRISPR Screens in CD8 T Cells. Cell 178, 1189–1204.e23.

[13] Guo, J., and Xu, C. (2020). Screening for the Next-Generation T Cell Therapies. Cancer Cell 37, 627–629.

[14] Gurusamy, D., Henning, A.N., Yamamoto, T.N., Yu, Z., Zacharakis, N., Krishna, S., Kishton, R.J., Vodnala, S.K., Eidizadeh, A., Jia, L., et al. (2020). Multi- phenotype CRISPR-Cas9 Screen Identifies p38 Kinase as a Target for Adop- tive Immunotherapies. Cancer Cell 37, 818–833.e9.

[15] Manguso, R.T., Pope, H.W., Zimmer, M.D., Brown, F.D., Yates, K.B., Miller, B.C., Collins, N.B., Bi, K., LaFleur, M.W., Juneja, V.R., et al. (2017). In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature 547, 413–418.

[16] Roth, T.L., Li, P.J., Blaeschke, F., Nies, J.F., Apathy, R., Mowery, C., Yu, R., Nguyen, M.L.T., Lee, Y., Truong, A., et al. (2020). Pooled Knockin Targeting for Genome Engineering of Cellular Immunotherapies. Cell 181, 728–744.e21.

[17] Shifrut, E., Carnevale, J., Tobin, V., Roth, T.L., Woo, J.M., Bui, C.T., Li, P.J., Di- olaiti, M.E., Ashworth, A., and Marson, A. (2018). Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell 175, 1958–1971.e1915.

[18] Wei, J., Long, L., Zheng, W., Dhungana, Y., Lim, S.A., Guy, C., Wang, Y., Wang, Y.D., Qian, C., Xu, B., et al. (2019). Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature 576, 471–476.

[19] Chen, J., Lo ́ pez-Moyado, I.F., Seo, H., Lio, C.J., Hempleman, L.J., Sekiya, T., Yoshimura, A., Scott-Browne, J.P., and Rao, A. (2019). NR4A transcription fac- tors limit CAR T cell function in solid tumours. Nature 567, 530–534.

[20] Moon, E.K., Wang, L.C., Dolfi, D.V., Wilson, C.B., Ranganathan, R., Sun, J., Kapoor, V., Scholler, J., Pure ́ , E., Milone, M.C., et al. (2014). Multifactorial T- cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen re- ceptor-transduced human T cells in solid tumors. Clin. Cancer Res. 20, 4262–4273.

[21] Stromnes, I.M., Schmitt, T.M., Hulbert, A., Brockenbrough, J.S., Nguyen, H., Cuevas, C., Dotson, A.M., Tan, X., Hotes, J.L., Greenberg, P.D., and Hingorani, S.R. (2015). T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immu- nologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell 28, 638–652.

[22] Fraietta, J.A., Lacey, S.F., Orlando, E.J., Pruteanu-Malinici, I., Gohil, M., Lundh, S., Boesteanu, A.C., Wang, Y., O’Connor, R.S., Hwang, W.T., et al. (2018a). Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat. Med. 24, 563–571.

[23] Fraietta, J.A., Nobles, C.L., Sammons, M.A., Lundh, S., Carty, S.A., Reich, T.J., Cogdill, A.P., Morrissette, J.J.D., DeNizio, J.E., Reddy, S., et al. (2018b). Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature 558, 307–312.

[24] Long, A.H., Haso, W.M., Shern, J.F., Wanhainen, K.M., Murgai, M., Ingaramo, M., Smith, J.P., Walker, A.J., Kohler, M.E., Venkateshwara, V.R., et al. (2015). 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 21, 581–590.

[25] Lynn, R.C., Weber, E.W., Sotillo, E., Gennert, D., Xu, P., Good, Z., Anbunathan, H., Lattin, J., Jones, R., Tieu, V., et al. (2019). c-Jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature 576, 293–300.

[26] Stadtmauer, E.A., Fraietta, J.A., Davis, M.M., Cohen, A.D., Weber, K.L., Lan- caster, E., Mangan, P.A., Kulikovskaya, I., Gupta, M., Chen, F., et al. (2020). CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science 367, eaba7365.

[27] Poorebrahim, M., Melief, J., Pico de Coana, Y., Wickstrom, S.L., Cid-Arregui, A., and Kiessling, R. (2021). Counteracting CAR T cell dysfunction. Oncogene 40, 421–435.

[28] Sakuishi, K., Apetoh, L., Sullivan, J.M., Blazar, B.R., Kuchroo, V.K., and Anderson, A.C. (2010). Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J. Exp. Med. 207, 2187–2194.

[29] Singer, M., Wang, C., Cong, L., Marjanovic, N.D., Kowalczyk, M.S., Zhang, H., Nyman, J., Sakuishi, K., Kurtulus, S., Gennert, D., et al. (2016). A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells. Cell 166, 1500–1511.e1509.

[30] Zheng, C., Zheng, L., Yoo, J.K., Guo, H., Zhang, Y., Guo, X., Kang, B., Hu, R., Huang, J.Y., Zhang, Q., et al. (2017). Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169, 1342–1356.e1316.

[31] Li, H., van der Leun, A.M., Yofe, I., Lubling, Y., Gelbard-Solodkin, D., van Akkooi, A.C.J., van den Braber, M., Rozeman, E.A., Haanen, J., Blank, C.U., et al. (2019). Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma. Cell 176, 775–789.e718.

[32] Mognol, G.P., Spreafico, R., Wong, V., Scott-Browne, J.P., Togher, S., Hoffmann, A., Hogan, P.G., Rao, A., and Trifari, S. (2017). Exhaustion-associated regulatory regions in CD8+ tumor-infiltrating T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, E2776–E2785.

[33] Milner, J.J., Toma, C., He, Z., Kurd, N.S., Nguyen, Q.P., McDonald, B., Quezada, L., Widjaja, C.E., Witherden, D.A., Crowl, J.T., et al. (2020). Heterogenous Populations of Tissue-Resident CD8+ T Cells Are Generated in Response to Infection and Malignancy. Immunity 52, 808–824.e7.