Cell丨曲线救国：胃泌素释放肽的去抑制微环路

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大脑皮层的信息传播方式多种多样，主要分为兴奋性、抑制性、去抑制性等等。神经元之间的直接突触连接能让各种行为快速精准地完成，使大脑在不同的状态之间切换自如。除了这种直接突触连接，还有一种以神经元表达神经肽，并通过释放神经肽到突触外、与其特异性受体结合的通讯方式。最典型的例子是多巴胺释放到多巴胺受体表达的脑区（比如纹状体），调节一系列奖赏行为。

胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）是一种在中枢神经系统广泛存在的神经肽，它与胃泌素释放肽受体（GRP receptor，GRPR）之间的亲和性很高，在不同脑区的表达能参与不同的功能，比如痒觉（itch）、叹气（sighing）、恐惧记忆等等。GRP参与这些行为背后的机制为何？

近日，哈佛大学医学院的Bernardo Sabatini（ David M. Sabatini的亲兄弟）团队在Cell上发表了文章Bombesin-like peptide recruits disinhibitory cortical circuits and enhances fear memories，通过一系列分子生物学、遗传学、行为学研究，揭示了丘脑胃泌素释放肽GRP在恐惧记忆中扮演的重要角色：GRP通过激活表达GRPR的听觉皮层（auditory cortex，ACx）血管活性肠肽神经元（vasoactive intestinal peptide，VIP），开启了VIP去抑制微环路之旅，最终“曲线救国”激活了兴奋性神经元，增强了听觉记忆。

研究人员最开始在已有的单细胞转录组数据库中找到了VIP神经元特异性表达的GRP受体蛋白，并通过荧光原位杂交的方法，发现GRP蛋白在皮层区域几乎只存在于兴奋性细胞中（96%），而GRPR蛋白存则在于大部分的抑制性VIP神经元中（81%），并且在发育过程中高度保守。不仅如此，他们在人类的视皮层区域也检测到了大量表达GRPR的VIP神经元，这说明GRP-GRPR信号通路在进化中也是保守的。

有意思的是，如果用伪狂犬病毒逆行示踪找到听觉皮层VIP神经元上游的细胞，发现只有很少部分细胞表达GRP，这说明GRP-GRPR的信号传导并非通过直接的突触连接。为了进一步证实这一推测，研究人员通过光遗传学方法激活杏仁核-皮层环路（主要为GRP阳性细胞），同时记录下游皮层VIP细胞和周围锥体细胞的兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic currents, EPSC），结果发现听觉皮层细胞依然没有对上游的光刺激产生响应。但如果用GRP传感器GrpLight来检测荧光标记的GRP，则可以清楚的看见GRP是分泌到突触外、缓慢弥散到其他区域的，这种弥散持续超过一小时，最终可到达遥远的其他皮层区域。也就是说，GRP在此主要是通过扩散作用，而不是突触连接产生效用。

那么，GRP扩散到表达GRPR的VIP神经元中会怎样呢？研究人员通过全细胞记录听觉皮层的VIP神经元发现，如果在缓冲液中加入GRP，VIP神经元会被激活，相比之下，其他位于听觉皮层的神经元（比如SST神经元、PVALB神经元、锥体神经元），则对GRP的反应很小，这说明GRP对VIP的作用有高度特异性。不仅如此，研究人员还利用钙信号成像技术捕捉到了加入GRP之后VIP细胞内的钙信号响应，进一步证实了GRP对VIP细胞的正向调控作用。

在皮层内，VIP神经元主要功能是抑制SST神经元和PVALB神经元活性，那么GRP作用于VIP神经元是否会导致类似的效果呢？为了解决这个问题，研究人员记录了SST和PVALB细胞在加入GRP后的抑制性突触后电流（inhibitory postsynaptic current，IPSC），果然他们发现，加入GRP后，SST和PVALB神经元的IPSC频率升高了，但EPSC没有变化，这说明GRP-VIP环路抑制了SST和PVALB细胞活性。

锥体细胞的兴奋性大小与SST细胞对它的抑制作用强弱息息相关，研究人员推测：既然VIP细胞抑制了SST细胞，理论上VIP对锥体细胞就会产生去抑制作用，从而间接激活锥体细胞。事实是否如此呢？为了验证这一假说，研究人员在小鼠运动皮层M1注射了GRP，接着通过观察即刻早期基因Fos和Npas4的表达谱来观察被GRP激活的下游细胞，果然，他们发现几乎所有被激活的细胞都是VIP神经元和谷氨酸能兴奋性神经元，而SST和PVALB神经元则鲜有标记，这个实验证明GRP-VIP环路能对锥体细胞产生去抑制作用。

最后，为了研究GRP在小鼠行为中的功能，研究人员采用了听觉分辨恐惧条件范式（auditory discriminatory fear conditioning），这一范式不仅需要听觉皮层的活性，而且在过去的研究中被证明需要去抑制环路的调控。通过在体钙成像技术，他们发现在听觉皮层灌注GRP会增加VIP细胞的钙信号的峰值大小。如果基因敲除VIP细胞的GRPR，则发现被敲除小鼠在记忆提取阶段，对恐惧的记忆大大降低（表现为冻结行为减少），而如果在GRP敲除的小鼠上通过CRISPR-Cas9靶向敲除GRPR序列或控制序列，则实验组和控制组小鼠的学习能力并没有差别，这说明GPR-GRPR通路在听觉皮层的记忆形成中起着重要的作用。

神经肽-神经肽受体介导的神经环路虽早有报道，但关于它的功能性研究依然寥寥可数。本文直接深入地研究了这一并非“点对点”，而是通过扩散传播的环路调控方式，为今后对神经肽作用于下游细胞的功能性研究提供了重要的参考。