第一作者：万堃
通讯作者：于鑫
通讯单位：厦门大学环境与生态学院
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近日，厦门大学环境与生态学院于鑫教授团队在环境领域著名学术期刊Water Research上发表了题为“Ancient Oriental Wisdom still Works: Removing ARGs in Drinking Water by Boiling as compared to Chlorination”的论文。论文系统评估了煮沸消毒对饮用水中抗性基因的去除效果并探讨了去除机制。通过与氯消毒对比，本文发现了煮沸消毒在应对抗性基因污染中的优势。本文的研究结果对烧开水这种古老东方智慧的推广提供了理论依据。细菌抗生素抗性是21世纪人类健康的重要威胁之一，作为抗生素抗性的遗传信息载体，抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）被定义为新型的环境污染物。近年来，国内外研究在市政饮用水中普遍检出ARGs甚至抗性细菌（antibiotic resistant bacteria,ARB），凸显出饮用水细菌抗生素抗性问题的严峻。作为饮用水安全的保障，水处理工艺（如混凝沉淀、砂滤、氯消毒等）能在一定程度上去除ARGs，但自来水厂的出厂水中依然会有相当数量的ARGs残留。从水源水到龙头水，细菌生物膜存在于水处理和给水的各个环节（黏附于滤池滤料、给水管网和构筑物表面），这些生物膜被报道携带高丰度、高多样性的ARGs。由于生物膜会老化并脱落，新的ARGs污染会不断引入，致使饮用水细菌抗生素抗性问题难以在水处理和给水过程中彻底解决。在这样的背景下，需要通过用户端消毒去除残留的ARGs以提高饮用水的生物安全性。喝开水是中国人的饮水传统，烧开水这种消毒方法植根于中华饮茶文化并广泛传播海外，这种古老的东方智慧传承已久。如今，将水煮沸依然是最有效的饮用水消毒方法，虽然相对较高的能耗限制了煮沸在水处理中的应用，但凭借优异的消毒性能和极低的硬件门槛，煮沸消毒依然在世界范围内被广泛使用。然而煮沸消毒这种东方智慧对新型污染物ARGs的去除效果还鲜有报道。本文以大肠杆菌和环境菌群为受试细菌，以氯消毒为对照：1）研究了加热煮沸（包括巴氏消毒）对细菌的灭活效果（基于异养菌平板计数）；2）在灭活环境细菌的实验中，研究了煮沸消毒对细菌群落结构的作用（基于high-throughput sequencing）和对抗性基因组的去除（基于high-throughput qPCR）；3）在灭活大肠杆菌的实验中，研究了煮沸消毒对胞内外ARGs的去除以及加热煮沸中胞内ARGs的释放规律（基于real-time qPCR）；4）通过检测DNA完整性，研究了高温加热对DNA分子结构的破坏（基于Agilent 2100 Bioanalyzer）。图文导读
消毒前后可培养细菌数的变化
图1.（a）大肠杆菌消毒（~108 cells/ml）和（b）环境菌群消毒（~107 cells/ml）。高加热强度是指升温速率为40℃每分钟，低加热强度是指升温速率为10℃每分钟。柱状图为三个实验重复的平均值，误差棒为重复实验的标准偏差。大肠杆菌和环境细菌的消毒实验结果如图1所示，氯消毒30分钟对大肠杆菌的灭活为3.14 - 7.13 logs，对环境菌的灭活为1.6 – 1.9 logs。巴氏消毒较氯消毒有更好的杀菌效果，低温巴氏消毒（60℃维持30分钟）对大肠杆菌的灭活达6.95-7.25 logs，高温巴氏消毒（75℃/90℃维持15秒）后几乎没有大肠杆菌的检出。在所有的消毒方式中，煮沸对细菌的灭活效果最好。煮沸后大肠杆菌无法检出。延长煮沸时间能明显提高细菌灭活的效果，煮沸3分钟对环境菌的灭活高达 7.4 logs。值得注意的是，增加加热强度对细菌灭活似乎没有贡献。我们发现所有消毒方式对大肠杆菌的灭活效果均优于环境细菌，即便前者比后者高出近一个数量级（图1）。环境细菌灭活的低效可能由其中的耐热或耐氯细菌所致（图2），胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）也可能是低效的原因。胞外聚合物可作为屏障，也可促使细菌形成团聚体，以抵挡消毒剂（如氯）对细胞的破坏。我们在对照组中检出了Zoogloea（动胶菌属，相对丰度为0.08%），该属是污水处理中活性污泥形成的关键属，能产生大量的EPS。![]()
图2. 巴氏消毒、煮沸和氯消毒（30分钟）对环境菌群细菌群落结构的改变。这里优势属是指在任意样品中相对丰度大于1%的属。高通量测序在环境菌群（对照组）中共检出1051个OTUs，经巴氏消毒、煮沸和氯消毒后，OTU数均显著减少。对照组检出了16个优势属（图2，相对丰度＞1%），这些属的平均相对丰度为2.8%。经巴氏消毒、煮沸和氯消毒后，优势属分别减少至13个、11-12个和4-6个，它们的平均相对丰度则分别增加至6.5 - 7.0%、7.1 - 8.4%以及15.6 - 23.4%。这些数据表明，加热煮沸和氯消毒筛选出了耐热和耐氯菌群。例如，对照组中Acinetobacter（不动杆菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）的相对丰度共计8.7%，在煮沸10分钟和氯消毒30分钟后相对丰度分别升高至59.5%和74.6%，这两种菌属被普遍报道耐氯且耐高温（如芽孢杆菌可形成内生孢子来抵御不利环境）。对比消毒效果，我们发现巴氏消毒和煮沸对不同菌属的灭活更均匀，而氯消毒的选择性更强，这种差异可能由热和氯传质效率决定。![]()
图3. 高加热强度是指升温速率为40℃每分钟，低加热强度是指升温速率为10℃每分钟。在环境细菌的消毒实验中，检测消毒前后的抗性基因组（如图3所示）。结果表明煮沸对ARGs的去除谱明显广于氯消毒和巴氏消毒。环境菌群（对照组）共检出了137种ARGs和7种可移动遗传因子（mobile genetic elements，MGEs），这些基因在煮沸10分钟后几乎被完全去除，而氯消毒（5 mg/L）30分钟只去除了13种ARGs。此外，氯消毒对aacC、aadA9、acrA、cmx(A)、mexE和oprJ等ARGs几乎没有影响，这也表明氯消毒对环境ARGs的去除具有选择性。氯对ARGs的选择性去除已有广泛报道。本研究中氯消毒筛选出了Acinetobacter（不同杆菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属），这两个属包含多种致病菌（Acinetobacter baumannii鲍曼不动杆菌、Bacillus anthracis炭疽芽胞杆菌、Bacillus cereus蜡样芽胞杆菌等），这些细菌均被报道多重耐药。例如，人们发现鲍曼不动杆菌可以抗氨基青霉素类抗生素、第一代和第二代头孢菌素、以及氯霉素，且能发展出对广谱β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类抗生素的抗性，这种可延展的抗生素抗性归功于鲍曼不动杆菌独特的基因组结构，可以通过水平基因转移获取不同种类的ARGs。综上所述，不论从细菌灭活，还是从ARGs去除的角度，煮沸均比氯消毒表现出更高的安全性。
图4：在加热煮沸和氯消毒过程中（初始氯浓度为1和5mg/L），细胞内和外基因（blaTEM、tetC和16S rDNA）含量的变化。该消毒实验在大肠杆菌悬液中开展。图中各点为三个实验重复的平均值，误差棒为重复实验的标准偏差。DNA在细胞外依然可能保持生物活性，消毒中未被完全破坏的ARGs有被细菌转化的风险。我们以携带PBR322质粒（blaTEM和tetC）的大肠杆菌为受试菌，研究了消毒对胞内外ARGs的去除及消毒过程中胞内ARGs的释放规律。如图4所示，低温加热（＜80℃）对胞内ARGs的影响不大，却导致了胞外ARGs的累积（升高0.49 – 0.98 log copies/ml），表明低温加热引起了胞内ARGs的释放。氯消毒前期同样检测到胞内ARGs的释放，但ARGs释放量和释放时间在初始氯浓度增加后显著下降。随着温度的升高（＞90℃）和氯消毒时间的延长，胞内外ARGs含量均显著下降。在煮沸0.5分钟、1 mg/L氯消毒120分钟、及5 mg/L氯消毒30分钟后，胞内外ARGs含量降至检出限下。不少研究报道热处理和氯消毒均会破坏细胞膜并导致胞内物质如DNA的释放。我们的研究发现，ARGs的释放不会显著影响胞内ARGs的含量，这是由胞内外ARGs含量的显著差异决定的，胞内小部分ARGs的释放即可导致胞外ARGs含量的显著升高。一个值得注意的现象是，50℃- 80℃的热处理会促进细胞释放ARGs。考虑到该温度范围的热处理不会让质粒DNA失去水平转移的能力，我们推测低温巴氏消毒（60℃- 80℃）可能增加ARGs水平转移的风险。
加热和氯消毒对扩增子DNA的降解![]()
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图5：加热和氯消毒（5 mg/L）30分钟后扩增子DNA（浓度为3.29 ng/μl）的降解。a）基于Agilent 2100生物分析仪的DNA电泳分析；b）DNA分子大小分布，检测过程中添加了DNAmarker，用以标记大小为50 bp和17000 bp的DNA分子。我们以blaTEM为模板，经PCR扩增得到长度为531 bp的扩增子，用以研究高温处理和氯消毒对DNA结构的破坏（图5）。生物分析仪的电泳结果表明，低温加热（＜81.3℃，维持30分钟）对DNA完整性不造成影响，高温加热则显著破坏了DNA的完整性（＞90.1℃，维持30分钟），氯消毒也会破坏DNA的完整性，其破坏程度与消毒时间正相关。该实验通过检测染料（Agilent DNA 12000 kit）与双链DNA结合后发出的荧光信号来判定DNA的完整性。基于此，我们认为高温导致了DNA的变性，使其从双链熔解为单链结构而失去完整性。不少研究报道氯通过选择性攻击核苷酸碱基来破坏DNA结构，这种破坏速度较缓且有剂量效应。我们发现氯消毒能有效去除ARGs（图4）却难以破坏DNA结构（图5），我们推测DNA被氯攻击后失去了扩增能力（即通过PCR无法检测到ARGs），但本身的结构依然相对完整。与双链DNA相比，单链DNA的生物活性低，很难被细菌转化，因此，煮沸后的ARGs在理论上水平基因转移的风险很低，甚至没有风险。另一方面，由氯消毒引起的DNA碱基损伤是可以被生物修复的，该过程由细胞中的相关酶驱动，这些修复途径增加了氯消毒后ARGs水平基因转移的风险，特别是当细菌没有完全灭活时。此外，氯作为氧化剂会被各类还原物（如水中的有机物、其他细胞组分等）消耗而产生局部的浓度差（如胞内和胞外），而升温过程中热传递是相对均匀的，这种传质差异也会影响ARGs的破坏效果。从这些角度看，煮沸是一种更安全的消毒方法。用户端消毒是解决市政饮用水细菌抗生素抗性问题的有效途径。本文研究了煮沸这种古老的东方智慧在去除抗性基因上的表现。在消毒复杂环境菌群时，煮沸较氯消毒和巴氏消毒表现出更广谱且更高效的杀菌能力和ARGs去除能力。加热过程（＜80℃）虽会导致胞内ARGs的释放，但温度升高后（＞90℃）胞内外ARGs均能被有效去除。从原理上看，高温引起的DNA变性会影响DNA生物活性并降低ARGs水平基因转移的风险。这些研究结果表明，在应对ARGs这种新型污染物时，煮沸表现出比氯消毒更高的安全性。尽管加热煮沸的能耗较高，但随着能源技术的进步，烧开水这种古老的东方智慧将来依然值得被推广。本项目得到了国家自然科学基金委和厦门市科技局的资助。
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通讯作者：于鑫，厦门大学特聘教授，国家级百千万人才工程入选者。担任Chemosphere、Sustainability编委，全国给水深度处理委员会理事，中国生态学会微生物生态学专业委员会副主任。研究方向为水处理技术和水处理微生物学，近年来的研究兴趣主要集中在饮用水中新型微生物污染物传播扩散及控制方面。主持国家自然科学基金等各类项目30余项。在ES&T、Water Research等SCI期刊发表论文80余篇，国内核心期刊发表论文60余篇，获授权发明专利10余项。
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第一作者：万堃，男，博士后，现就职于厦门大学环境与生态学院。
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