ACS Chem. Biol.｜小分子生物偶联剂与氢氘交换质谱结合揭示细胞色素P450变构调节

原创罗宇翔，李惠琳李惠琳课题组

大家好，本周为大家分享一篇发表在ACSChem. Biol.上的文章，Combining Small-Molecule Bioconjugation and Hydrogen−Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) to Expose Allostery: the Case of Human Cytochrome P450 3A4¹。该文章的作者是麦吉尔大学的Karine Auclair和Christopher J. Thibodeaux。

变构调节是生物大分子中常见的一类现象，其可以使结构信息在不同结构位点发生传播。例如当效应分子结合在蛋白上时，结合作用通过蛋白分子内相互作用力的重排从而在远端调控蛋白功能。因此，变构调节可以为新药研发提供独特的靶点。人细胞色素P450酶（CYPs）是一类血红素单加氧酶，其亚型CYP3A4在药物代谢、药物相互作用以及耐药性起到一定作用，且已被报道表现出变构调节行为。然而，鉴于CYP3A4的配体结合情况复杂（结合位点多、存在配体重新定位效应且变构效应剂可能与底物发生竞争而被氧化），从结构生物学的角度表征变构效应剂的机理是一大挑战。

氢氘交换质谱（HDX-MS）因其能监测蛋白结构柔性以及蛋白动态变化而适用于表征蛋白质的变构调节效应。但因CYP3A4可以同时结合多配体以及潜在的配体重新定位效应，使得该体系的HDX-MS数据解析变得十分复杂。同时，HDX-MS也较难区分所观察到的蛋白动态变化是直接与配体结合相关联的，还是由于氢键网络变化所导致的。因此，为了克服这些限制，作者在本文中将生物偶联剂技术与HDX-MS联用，即解决了因多配体结合导致的高异质性，又排除了配体重新定位效应的干扰。

本文的研究对象是CYP3A4与其一广泛研究的底物兼正向效应剂孕酮（PRG）。在先前的研究中，作者开发了一款生物偶联剂马来酰胺-孕酮（PGM）²，其可以特异性标记在Cys残基上，当我们希望研究某位点上的PGM结合效应时，可以将该位点突变为Cys继而标记，以考察固定位点的配体结合效应以及別构调节效应。本文通过该方法，考察了变构模拟物（F108C-PGM、F215C-PGM）、激动剂（L482C-PGM）以及拮抗剂（G481C-PGM）所产生的结构效应。

首先是变构模拟物F108C-PGM、F215C-PGM的HDX-MS结果。如图1，F108C-PGM和F215C-PGM产生的HDX变化类似（红色表示氘代增加区域，蓝色表示氘代减少区域）。该两个位点的结合效应显示出相似的变构调节作用（图2A）。

图1. 不同变构类似物的△HDX结果，晶体结构中蓝色表示氘代减少区域，红色表示氘代增加区域。下方为代表性肽段的HDX曲线。

接着是拮抗剂（G481C-PGM）和促进剂（L482C-PGM）的HDX-MS结果。如图2B，拮抗剂体系结果显示，C、F、F′、H helices和K/β1 loop结构都变得更为刚性，而激动剂体系中（图2C）发现C、F helices反而表现得更为动态。因此这些区域的柔韧性可能跟变构调节效应相关。

图2. (A) F108C-PGM和F215C-PGM显著性氘代差异区域叠加图。(B)拮抗剂G481C-PGM的△HDX结果。(C)激动剂L482C-PGM的△HDX结果。

上述展示的HDX实验结果中，氘代模式遵循EX2动力学模式。然而在未呈现出的数据中，某些区域的肽段还部分表现出了EX1动力学模式。通常我们认为，发生EX1氘代动力学模式的区域，因其谱图中呈现出双峰模式，较难定量其氘代位移值，所以其HDX数据分析是有难度的。但在本文中，作者发现，发生EX1动力学模式的区域产生的肽段，仍包含一定的结构信息。发生该动力学模式的区域主要集中在图3A所示区域。而图3B中比较了加/不加配体时的谱图，作者发现，当加上配体后，双峰相对强度会偏向低质荷比的峰位移，这意味着该区域存在着细微的结构变化。值得注意的是，该现象只发生在变构类似物体系中，而拮抗剂和激动剂体系中不存在该现象。这可能表明，PGM与 F108C 和F215C中变构口袋的结合改变了C、F和F' helices的低交换和高交换构象之间的平衡。

图3. (A)发生EX1动力学模式的区域。(B)不同区域加/不加配体时双峰谱图的变化。(C)不同区域氘代程度随时间的变化。气泡的大小表示未交换（浅色）和高度交换（深色）类群的相对比例。

最后，作者分析了游离的PRG与CYP3A4结合时的HDX变化情况。如图4A，相对于上文结果， A/A'、G 和 I helices区域显示出更为动态，而F、F' 和 G' helices的显著性变化消失了，由此也展现出了多配体结合位点以及配体重新定位效应给HDX-MS分析带来的局限。同时，作者也监测到了PRG与正常底物竞争发生催化作用而产生的产物羟基化-PRG（图4B），由此也更加证明CYP3A4中存在的多结合位点。

图4. (A)PRG与CYP3A4结合时的△HDX结果。(B)PRG氧化产物的HPLC分析。

总的来说，本文将生物偶联剂技术与探究变构效应思路联合起来，排除了多配体结合位点、配体重新定位的干扰，增强了结合的特异性，使其在HDX-MS中尽可能深地挖掘特定配体结合位点的变构调节作用。同时，将发生EX1动力学的肽段信息利用起来，辅助鉴定结构变化，提示着我们EX1肽段也可能隐藏一些结构动态信息。

撰稿：罗宇翔

编辑：李惠琳

原文：Combining Small-Molecule Bioconjugation and Hydrogen−Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) to Expose Allostery: the Case of Human Cytochrome P450 3A4

李惠琳课题组网址

www.x-mol.com/groups/li_huilin

参考文献

1. Ducharme, J.; Polic, V.; Thibodeaux, C. J.; Auclair, K., Combining Small-Molecule Bioconjugation and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) to Expose Allostery: the Case of Human Cytochrome P450 3A4. ACS Chem. Biol. 2021.

2. Ducharme, J.; Polic, V.; Auclair, K., A Covalently Attached Progesterone Molecule Outcompetes the Binding of Free Progesterone at an Allosteric Site of Cytochrome P450 3A4. Bioconjug. Chem. 2019, 30 (6), 1629-1635.

继续滑动看下一个