论文｜猪流行性腹泻病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立
作者：芮聪杰1,2，潘孝成1*，沈学怀1，赵瑞宏1，尹磊1，戴银1，胡晓苗1，侯宏艳1，周学利1，张丹俊1
单位：1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室；2.伊宁市动物卫生监督所
简介：芮聪杰，河南漯河人，硕士，从事畜禽传染病研究。*通信作者，副研究员，博士，从事畜禽传染病研究。
基金项目：安徽省科技重点研发项目 （1704a07020066）；安徽省农业科学院平台项目（2020YL094）；安徽省生猪产业技术体系项目（AHCYTX-05-09）；安徽省科技重大专项（17030701008）。
来源：《安徽农业科学》2020年19期
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种以水样腹泻、脱水、呕吐为主要特征的急性、高度接触性肠道传染病，各个品种和各个年龄阶段的猪均易感，尤其对刚出生至10日龄以内的哺乳仔猪影响最为严重，表现为高病死率，病死率可高达100%。
猪流行性腹泻的早期诊断和猪群抗体水平的检测，对该病的预防与控制起着关键性作用。ELISA 检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应快速、操作相对简单以及可对血清进行批量检测等特点，因而在人和动物疫病的血清学抗体检测中应用广泛。
建立检测血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法，旨在为有效开展PED防控提供依据。
以PEDV重组N蛋白及纯化全病毒为包被抗原，建立2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，对PEDV IgG抗体血清进行检测。
◆ 间接ELISA方法的建立及反应条件确定
经测定，该试验保存的浓缩纯化PEDV全病毒和重组N蛋白浓度分别为3.95和1.23mg/mL，以其为包被抗原，分别建立检测PEDV IgG抗体的间接ELISA检测方法。采用方阵滴定法，确定了最佳反应条件（表1）。
◆ 阴阳性临界值的确定
用该试验建立的2种间接ELISA方法分别检测44份阴性血清样品，结果显示以PEDV全病毒作为包被抗原，当样品OD450nm≥0.440时判定为阳性，当样品OD450nm≤0.365时判定为阴性，当样品OD450nm介于二者之间时判为可疑；以重组N蛋白为包被抗原，当样品OD450nm≥0.434时判定为阳性，当OD450nm≤0.355时判定为阴性，当样品OD450nm介于二者之间时判为可疑。
◆ 特异性试验
用该试验建立的2种间接ELISA方法在相同的反应条件下，分别对TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性血清样品进行检测，并设置PEDV阴阳性血清样品作为对照，结果显示，除阳性血清样品外，其余样品结果均呈阴性（表2），表明该试验建立的2种间接ELISA方法均具有较好的特异性。
◆敏感性试验
对该试验建立的2种间接ELISA方法进行敏感性检测，结果显示（图1），以PEDV全病毒作为包被抗原，当阳性血清样品稀释到1∶1600时仍可检测为阳性（OD450nm=0.497）；以PEDV重组N蛋白为包被抗原，当阳性血清样品稀释到1∶800时仍可检测为阳性（OD450nm=0.478）。这说明建立的2种间接ELISA方法均具有良好的敏感性。
图1 间接ELISA的敏感性试验结果
◆重复性试验
由表3可知，2种间接ELISA方法的批内和批间变异系数均为2.50%~8.23%，变异系数均小于10%，表明该试验建立的2种间接ELISA方法均具有良好的可重复性。
◆临床样品的检测
用该试验建立的2种间接ELISA方法，分别检测245份来自5家猪场的血清样品，结果显示以PEDV全病毒作为包被抗原，检测样本的阳性率为81.22%（199/245）；以重组N蛋白为包被抗原，检测样本的阳性率为79.59%（195/245）。这2种方法的检测符合率为95.92%（235/245）。
核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白是PEDV4种主要结构蛋白之一，研究表明其在病毒的复制以及诱导特异性免疫反应上发挥重要的作用，在感染早期能够诱导集体产生针对N蛋白的高水平抗体，因而利用N蛋白建立PEDV诊断技术具有很好的应用前景，试验所用PEDV重组N蛋白为畜禽产品安全工程安徽省重点实验室制备，且已证实其与PEDV阳性血清有良好的反应特异性。
PEDV的全病毒，由于病毒蛋白为天然构象，因而保留其全部的抗原表位，也使得以其为包被抗原建立的抗体检测ELISA方法，临床上检测特异性更强，阳性检出率更高。
该试验以纯化的PEDV全病毒和重组N蛋白抗原作为包被抗原，分别建立了检测猪血清中IgG抗体的间接ELISA方法，其阳性样品检测的最低稀释度分别为1∶1600和1∶800，批内和批间变异系数均小于10%（2.50%~8.23%），与TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性样品无交叉反应，说明该试验建立的2种检测PEDV IgG抗体的间接ELISA方法均具有良好的敏感性、重复性和特异性，均可用于检测和评估血清中PEDV感染和免疫产生的IgG抗体水平。
虽然以PEDV全病毒为包被抗原的阳性检出率（81.22%）略高于重组N蛋白（79.59%），但差异不显著，且2种方法对临床样品的检测符合率较高（95.92%），因此可根据实际情况选择应用。
♔采编：夏梦 ♔排版：小同