成也EIN2，败也EIN2
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通过上一讲的介绍，我们了解到，EIN2是乙烯信号通路中第一个起正调控作用的关键因子，它“伟光正”的高达形象已经深入人心。既然EIN2在乙烯信号转导通路中起到非常重要的作用，那么人们自然会好奇，它到底是如何发挥作用的呢？我们已经知道，EIN2定位在胞质中的ER膜上，而植物接受乙烯信号后要引起生物体的应答，必然会涉及细胞核中基因的表达调控，那么乙烯信号是如何通过EIN2从ER膜传递到细胞核中的呢？这一个又一个的问题，等着全世界的科学家们去回答。
2012年，是乙烯信号研究史上值得载入史册的一年。因为就在这一年，来自世界各地的三个实验室几乎同时发表文章，为我们揭示了EIN2介导乙烯信号转导的分子机制。
2012年8月， Joseph R. Ecker实验室在Science发表题为Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas的文章，揭示了EIN2由ER到细胞核转移的机制。在前期的研究中，Melanie M.A. Bisson等人通过保守结构域预测，在EIN2的C端发现了一个可能的核定位信号（NLS）。随后，Ecker实验室对该NLS的功能进行了深入研究。他们将野生型的EIN2-YFP融合蛋白转化至突变体ein2-5中，可以恢复突变体的表型；而将NLS突变后的EIN2Fm-YFP转化到ein2-5中后，突变体的表型并不能被互补，说明NLS是EIN2行使功能所必需的。
既然该NLS结构域是一个预测的核定位信号，那么EIN2蛋白是否具有核定位信号呢？研究人员用乙烯处理转化了EIN2-YFP融合蛋白的拟南芥发现，乙烯处理前EIN2-GFP定位在内质网上，而用乙烯处理10min后，即可在细胞核中发现EIN2-GFP的定位信号，并且随着处理时间的延长，信号强度也逐渐增强。而将NLS突变后，乙烯处理无法使EIN2Fm-YFP转移到细胞核。以上结果说明，乙烯处理会使EIN2由ER转移至细胞核，并且这种转移对EIN2行使正常的功能是必须的。
NLS影响EIN2的核定位【1】
那么，乙烯信号转导中的什么组分会影响EIN2的亚细胞定位呢？将EIN2-YFP分别转化至受体突变体etr1-1，ctr1-1和转录因子突变体ein3-1eil1-1中，发现etr1-1中ACC处理前后EIN2-YFG都不会出现核定位信号，而在ctr1-1中EIN2-YFP会出现组成型核定位，在ein3-1eil1-1双突中EIN2则能正常响应乙烯。以上结果说明ETR1和CTR1影响乙烯介导的EIN2由ER向细胞核的转移，而EIN3和EIL1对EIN2的定位没影响。
ETR1和CTR1影响EIN2的核定位【1】
我们在《乙烯信号简史》|“伟光正”EIN2中介绍过，按照保守结构域可将EIN2可分为两段：N端和C端。N端有12个保守的跨膜结构域，决定EIN2的ER定位。将EIN2的C端（CEND）在ein2-5中过表达，即可导致光下生长的幼苗出现组成型乙烯反应，并可持续激活乙烯响应基因的表达。而本文作者也发现，定位于细胞核的EIN2-CEND足以植株表现出乙烯反应。因此他们推测，当乙烯处理后，EIN2的C端被蛋白水解酶剪切，随后进入细胞核。为了验证上述推测，通过western blot检测乙烯处理后植物体内是否有内源的剪切后的EIN2形式存在。结果表明，乙烯处理后，确实在细胞核提取物中检测到了分子量更小的剪切后的EIN2-CEND肽段。
乙烯处理使EIN2-CEND剪切入核【1】
那么另一个问题就来了，EIN2的剪切位点在哪儿呢？Ecker实验室使用了MS并结合Pseudo-Multiple Reaction Monitoring技术检测EIN2可能的剪切位点，最终锁定在第645和646个氨基酸之间。随后，他们又使用了蛋白磷酸化组学方法，在空气中生长的黄化苗中提取出的EIN2上发现了3个高水平的磷酸化位点。有意思的是，其中的一个位点S645正好也是可能的剪切位点。那么，S645的磷酸化水平到底是否受乙烯影响呢？研究发现，空气处理的野生型中EIN2的S645被磷酸化，而乙烯处理后却不被磷酸化；而在ctr1-1突变体中，无法检测到S645的磷酸化。以上结果说明，EIN2 S645的磷酸化需要CTR1。
CTR1介导的EIN2 S645的磷酸化对其剪切入核有什么影响呢？研究人员在EIN2中引入了S645A的突变，使该位点丧失被磷酸化的功能。将突变后的EIN2转化至ein2-5中，可使植株出现组成型乙烯反应，并使EIN2-YFP出现组成型的剪切和核定位。转录组分析也发现，S645A突变可在转录水平持续激活乙烯响应。而可模拟磷酸化的S645E突变则不能恢复ein2-5的表型，同时EIN2-YFP也无法剪切入核。以上结果说明，乙烯可以抑制CTR1对EIN2的磷酸化，使EIN2的C端被剪切入核。
CTR1介导的EIN2磷酸化影响EIN2-CEND的剪切入核【1】
有意思的是，几乎与此同时，郭红卫实验室和Caren Chang实验室发表的文章，得到了与该文章几乎相同的结论。只能再一次感慨国际同行对于科技前沿问题的角逐和竞争有多激烈。都说文无第一武无第二，可是在学术圈，却永远只有第一，没有第二。
我们知道，自然界中的万事万物都必须维持一种相对平衡的状态，才能长久稳定地存在。既然EIN2在乙烯信号转导中具有如此关键的作用，那么它是不是就可以“为所欲为”，不受其他事物控制了呢？答案肯定是否定的，大自然绝对不允许如此不和谐的事情发生。
2008年Joseph R. Ecker实验室在GENES & DEVELOPMENT上发表题为Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis的文章，揭示了ETP1/ETP2调控 EIN2蛋白降解的机制。
我们在《乙烯信号简史》|“伟光正”EIN2曾经介绍过，在前期研究中发现，EIN2 mRNA对乙烯处理并没有反应。于是本文作者通过western blot检测EIN2是不是存在转录后调控。他们使用蛋白合成抑制剂CHX处理，检测EIN2蛋白的变化，发现CHX处理30min后，EIN2蛋白含量显著降低，2h后基本检测不到。说明EIN2蛋白的寿命极短，半衰期仅为30mim。进一步使用蛋白酶体抑制剂MG115和MG132处理，发现EIN2蛋白逐渐累积，并且还出现了分子质量更大的条带，说明EIN2蛋白可能存在被修饰的状态，并且很可能是泛素化修饰。进一步使用乙烯处理后发现，在野生型Col中EIN2蛋白会迅速累积，并且银离子可抑制该过程的发生。而etr1-1突变可抑制EIN2的积累，ctr1-1突变则导致EIN2组成型积累，ein3eil1中EIN2蛋白对乙烯的响应不受影响，说明乙烯促进EIN2蛋白的积累和乙烯反应相一致，并依赖于EIN3和EIL1上游的组分。
为了进一步揭示EIN2转录后调控的机制，研究人员使用EIN2-CEND为诱饵，进行了酵母双杂交筛选，筛选到了1个新的F-box蛋白ETP1（EIN2 TARGETING PROTEIN2）。经过蛋白序列比对，发现拟南芥基因组中还有另外一个蛋白和ETP1具有较高的一致性（50%），将其命名为ETP2。
EIN2-CEND和ETP1/ETP2互作【5】
将ETP1或ETP2过表达可以抑制EIN2的累积，并且转基因植株表现出非常强的乙烯不敏感表型。使用amiRNA降低ETP1和ETP2 mRNA的表达会导致EIN2蛋白积累，并使转基因植株出现组成型乙烯反应。另外，乙烯处理会降低ETP1和ETP2蛋白的含量，抑制它们与EIN2的互作。
综上所述，当没有乙烯时，ETP1/ETP2蛋白积累，通过泛素化途径降解EIN2蛋白，关闭乙烯信号途径；而有乙烯时，ETP1/ETP2蛋白被含量减少，EIN2稳定性增强，被切割入核，激活下游乙烯信号。
ETP1/ETP2通过调控EIN2的含量负调控乙烯信号【5】
由此联想到了韩信和萧何的典故，不禁要感慨一声：真是成也EIN2，败也EIN2！
在乙烯的帮助下，EIN2总算成功从内质网上解离下来了，由此开始了向细胞核的“朝圣之路”。可是，这一路途注定不会一帆风顺，中间又会发生怎样精彩的故事呢？
欲知后事如何，请听下回分解：《乙烯信号简史 | 入核“路漫漫”》。
参考文献
1. Qiao, H., Shen, Z., Huang, S. S. C., Schmitz, R. J., Urich, M. A., Briggs, S. P., & Ecker, J. R. (2012). Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas. Science, 1224344.2. Bisson, M. M., & Groth, G. (2011).New paradigm in ethylene signaling: EIN2, the central regulator of the signaling pathway, interacts directly with the upstream receptors. Plant signaling & behavior, 6(1), 164-166.
3. Ju, C., Yoon, G. M., Shemansky, J. M., Lin, D. Y., Ying, Z. I., Chang, J., … & Cooper, B. (2012). CTR1 phosphorylates the central regulator EIN2 to control ethylene hormone signaling from the ER membrane to the nucleus in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(47), 19486-19491.
4. Wen, X., Zhang, C., Ji, Y., Zhao, Q., He, W., An, F., … & Guo, H. (2012). Activation of ethylene signaling is mediated by nuclear translocation of the cleaved EIN2 carboxyl terminus. Cellresearch, 22(11), 1613.
5. Qiao, H., Chang, K. N., Yazaki, J., & Ecker, J. R. (2009).Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis. Genes & development.