药渡专栏作者干货：“单次急毒”~新药临床前毒理学评价的“先锋官”

原创强森药渡

强森

专栏作者

从事新药研发！学习一切与新药相关的知识！药学领域的一名小学生！

药品3大属性，“安全、有效、质量可控”，首当其冲即为“安全”，这是一切的前提！当然，药品研发过程中，在合理评估分子毒性的基础上最先筛的是药效，但在确定候选药物后，急需了解的即是药物的毒性。且在评估一系列安全毒理问题时，急毒问题往往先行，以充分暴露候选药物的潜在问题。

什么动物急毒试验？

动物的急毒试验（acute toxicity test，即广义的单次给药毒性试验），一般于新药开发研究的早期阶段进行，主要是观察一次或24h内反复给予实验动物受试药物后，所产生的毒性症状、症状严重程度及其症状出现和消失的时间，以及动物的死亡率等，以此计算出药物的LD50等参数。急毒试验具有简单易行、经济实用的特点，常作为新药药效学、长期毒理学试验以及进一步开发的基础。

为什么说急毒试验是临床前毒理学评价的“先锋官”

急毒试验，是新药研发早期/开发初期必须进行且理应最先进行的毒理学观察指标，该试验的进行有以下4个原因。

NO1~揭示候选药物急毒作用

我们开发的候选药物，到了一定剂量后，均会对机体产生毒性。急毒试验可观察24h内1次或多次给予药物后机体的中毒症状、特征、死亡情况，明确剂量-毒性反应关系，预测受试药物对任意的可能危害，推测受试药物毒性发生的速度和持续时间等。一般以急毒试验中得出的LD50及中毒死亡的起始时间、最长致死时间和平均致死时间等作为药物间毒性作用比较的指标。

通常情况下，毒性大、起效快的化合物导致动物死亡较快，而毒性小、起效慢的化合物则引起动物死亡相对慢。通过急毒试验，尚可根据受试药物的中毒症状及病理学检查等，了解急毒作用的主要靶器官等，为受试药物的毒理学研究提供初步的试验数据，并可以为长期毒性试验的剂量选择等提供参考。

NO2~确定候选药物毒理学参数

LD50是急毒试验过程中及其重要的指标。一般情况，LD50越小则毒性越大，对人体产生的危害越大。但单纯用LD50衡量药物的安全有效性并不科学，如果LD50值小，但同时ED50也很小，就不能片面的评价一个药物的毒性，则应使用治疗指数（TI=LD50/ED50）、安全范围（SM=（LD1/ED99-1））等指标。

NO3~为不良反应监测提供参考

急毒试验所获得的信息对长毒剂量的设计和药物I期临床试验的剂量选择具有重要参考价值，可为生殖毒、致突变等实验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息。并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。

NO4~提供新药急性中毒机制及治疗的可能线索

根据急毒试验中观察到的中毒症状及主要毒性作用靶器官信息，可推测受试药物急性中毒的可能解救措施，并为进一步阐明药物的中毒机制提供线索。

急毒试验方法

综上介绍，在急毒研究过程中，LD50数值极为重要！此外，除LD50相关试验外，最大给药剂量、最大耐受剂量、近似致死量试验、固定剂量试验，又是如何开展的呢？

&半数致死量试验&

LD50测定是最为常用的急毒试验方法。在急毒试验中，最小致死量是药物引起动物死亡的最小剂量，但由于药物的性质、给药方法和个体差异等原因，每只动物的最小致死量可能会差异很大，因此，常用一群动物的半数致死量来表示。半数致死量测定方法如下：

NO1~预试验

做预实验，是大多是科研的常规手段，预实验的目的是找到0~100%致死的剂量范围。一般应通过了解受试药物的化学结构和理化性质的资料及文献，以及查阅与受试药物化学结构近似或有共性基团化合物的毒理学资料，确定预试验的剂量范围。预试验一般每组4只动物，按照一定的剂量比（如1:10）递增或递减给药，给药后观察、记录动物的死亡数，找出4/4和0/4死亡的剂量组。两组之间按一定的剂量比进行重复试验，以此测得受试药物引起100%与0%的动物致死的剂量，即初步确定了试验的上限剂量（Dm）与下限剂量（Dn）。

NO2~正式试验

在预实验Dn和Dm剂量范围内等比设计5~7个剂量组，其剂量组间比值一般在1:0.65~0.85范围内；每组动物20只，雌雄各半，按照预试验的给药途径分别给药，连续观察至少2周并记录动物的死亡情况及出现的毒性反应症状等，计算受试药物的LD50。

给药后，一般连续观察至少2周，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重等）。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。

NO3~计算方法

LD50的计算方法可采用改良寇氏法、简化概率单位法、序贯法、孙瑞元点斜法和Bliss法等多种计算方法，其中Bliss法是目前公认最为精确且简单的计算方法，可满足LD50计算的准确性。

Bliss法一般要求试验组间的剂量比相等，各组试验动物数量相等，各组动物死亡率半数应分别分布于10~50%与50~90%之间。而改良寇氏法除要求各组动物数相等、组距等比外，还要求死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率＜20%，最高剂量组死亡率＞80%。

通过LD50的测定，可获得受试药物的LD50、95%可信限及量效关系斜率等相关数据信息。

&最大给药量试验&

在新药急毒试验中可能会出现无法测出受试药物LD50的情况，此时则应进行最大给药量试验。该试验系指受试药物在合理的最大容量和最高浓度条件下，以允许的最大剂量给予实验动物不产生死亡的药物剂量。一般在试验中会采用与受试药物临床试验相同的给药途径，以动物能耐受的最高浓度（药物溶液仍具有较好的流动性）、最大容量单次或24h内2~3次给予动物后，连续观察2周，不产生动物死亡的最大剂量即为最大给药量，以总给药量表示。一般在最大给药量试验中口服给药的小鼠动物数量至少为20只，雌雄各半，灌胃给药容量依次不超过0.4ml/10天，观察2周，记录一般状态指标和毒性反应情况。如仍未见一般状态等指标改变及毒性反应，即可将受试药物给予小鼠的灌胃量作为最大给药量。

&最大耐受量试验&

最大耐受量试验（MTD），是指单次给予动物受试药物，动物能够耐受而未发生死亡的剂量。最大耐受量试验一般需用20只动物，连续观察1~2周。虽然MTD是未引起动物死亡的剂量，但在测定过程中，应注意观察、记录受试药物引起动物的异常反应和病理现象，并综合评价受试药物的急毒。

&近似致死量试验&

一般采用健康的Beagle犬和猴进行试验，尽量采用与临床用药相同的给药途径，根据已有的参考资料设计可能导致动物死亡的剂量范围，设计10~20个给药剂量组，各剂量间按照50%递增。每间隔一个剂量给予1只动物，给受试药物后观察2周，找出最低致死量和最高非致死剂量，按照此二剂量之间的剂量给予1只动物，即为近似致死剂量。

&固定剂量试验&

固定剂量试验，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。试验一般选用大鼠，以明显的毒性体征作为评价指标。具体方法为再5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg和2000mg/kg~4个固定计量中选择一个作为初始计量，1只动物单次给予1个剂量，如未发生毒性反应，则升高1个剂量预试，如出现严重的毒性反应，则降低1个剂量试试。如试验结果出现2只动物均存活，则可在此2个固定剂量之间选择1个中间剂量预试（一般不超过5只动物）。通过预试验可在上述四个固定剂量中找出即可产生明显毒性但由不引起死亡的受试药物剂量，随后进行正式试验，每个剂量组至少10只动物，雌雄各半。给予受试药物后观察2周。

受试动物对应的观察指标

给药前后对动物的一般状况、毒性症状及死亡时间等指标要密切观察并记录，具体观察指标如下：

NO1~一般指标

包括动物的体重、进食、进水的情况，动物的外观、行为、对刺激的反应、分泌物以及排泄物等。其中，动物体重变化在给要钱、观察期间、试验结束时均应程中并记录。

NO2~毒性反应

给药后注意观察动物毒性反应出现的时间及其恢复时间、严重程度、动物死亡的时间等。观察的毒性症状及可能的毒性作用靶器官包括：“鼻孔呼吸阻塞、呼吸频率和深度改变、体表颜色改变”、“运动功能”、“惊厥”、“反射情况”、“眼睑指征”、“心血管指征”、“胃肠道指征”、“皮肤”，等。

NO3~动物死亡情况

在急毒试验期间及时记录所有死亡动物的死亡时间、濒死前反应、出现的症状，以及症状其实的时间、严重程度和持续时间等，以初步判断受试药物引起动物的急毒反应，以及毒性反应的靶器官。

NO4~病理学检查

所有的试验动物均应进行大体解剖，观察组织器官有无体积、颜色、质地等的改变。对一文或确有病理学改变的组织器官进行组织病理学检查，并做好相应的实验记录。

急毒试验结果评价

急毒试验的总结报告中应包括摘要、供试品、试验动物、试验环境、给药方法、观察方法等试验基本情况，同时应将观察到的毒性反应症状及出现的时间、严重程度、持续时间，以及体重变化、病理组织学变化和死亡出现的时间等记入报告中，其中组织病理学检查应有报告及病变组织的病理照片，报告中应附有病理学检查负责人签名和药品注册申请人盖章。

根据所得急毒试验结果计算LD50和LD95及其可信限，分析毒性反应的剂量-反应及时间-反应关系，初步推测受试药物的安全范围。根据所发生的的毒性反应，预测可能涉及的组织、器官或系统；进一步根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查初步确定可能的毒性作用靶器官。

最后应根据试验结果对急毒进行综合全面的评价，判断所出现的毒性反应与药物作用的相关性，综合分析受试药物的安全范围、毒性反应的严重程度及其可逆性，初步推测其毒性作用靶器官。

小结

上述内容，即为新药开发临床前毒理学评价急毒研究的简要内容，这仅仅是概述性的内容，在实操过程中还会遇到很多很多问题，无论合规性或者科学性方面...急毒初步了解后，接下来的问题即为“长毒”，将在下文中继续概述；同时，望抛砖引玉，共同学习进步，以了解药物的本质问题！

参考：

1. 《毒理学》. 第6版. 卡萨瑞特

2. 《新药研究与评价概论》.李晓辉.杜冠华

3. 《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）

4. 药物单次给药毒性研究技术指导原则. CDE

5. EMA.Questions and answers on the withdrawal of the“Note for guidance on single dose toxicity”.2010.

6. Nonclinical Safety Studies for the Conduct of HumanClinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals.2009.

7. EMA官网

8. FDA官网

9. CDE官网

药渡APP「积分新玩法」公司尽享数据库超值权限

扫二维码，购书

立即解锁你的掌上专业工具！

继续滑动看下一个