发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

菠菜(Spinacia oleracea L.)是苋科菠菜属植物。菠菜具有丰富的维生素等营养成分, 是我国栽培的主要绿叶菜品种之一。据联合国粮食及农业组织(FAO)数据, 我国是世界上最大的菠菜种植国家与消费国家, 2012年我国的菠菜产量已达到1900万吨, 约占世界菠菜总产量的90%。

随着人们对蔬菜品质和营养等需求的日益提高, 分子生物技术手段逐渐被用来进行蔬菜功能基因的挖掘鉴定和新品种培育。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtume faciens)介导, 以卸甲的Ti质粒中的T-DNA为媒介, 能够将目的基因导入植物中, 获得外源基因稳定表达的遗传改良株系。除了根癌农杆菌, 发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒, 将rol基因稳定整合到宿主植物基因组中, 产生毛状根。毛状根具有生长速度快, 遗传稳定等特点, 常用来作为重金属吸附、次生代谢合成和根发育调控等研究的模型。因此通过发根农杆菌介导可以同时将携带rol基因的Ri质粒T-DNA和携带外源基因的Ti质粒T-DNA共同整合到植物基因组中, 获得携带目的基因的毛状根。

2017年, 上海师范大学王全华课题组与康奈尔大学费章君课题组合作完成了菠菜品系SP75的全基因组测序, 为菠菜发育与逆境应答分子机理研究奠定了基础。目前亟需得到与该测序品种配套的的高效遗传转化体系, 用于菠菜功能基因的挖掘鉴定和分子设计育种。

近日, 上海师范大学戴绍军课题组与中国科学院青岛生物能源与过程研究所付春祥研究员课题组合作成功开发了菠菜毛状根遗传转化体系。该工作首先通过不同类型发根农杆菌的筛选, 获得侵染效率较高的LBA9402和K599菌株, 然后在此基础上对菠菜外植体的类型进行了筛选, 发现以茎器官为外植体, 发根诱导效率最高。进一步通过对获得的毛状根进行愈伤诱导和再生, 获得了菠菜毛状根再生植株, 建立了菠菜的毛状根诱导和再生体系(图1)。

图1 菠菜毛状根的再生体系

(A) 菠菜毛状根在愈伤诱导培养基上产生愈伤; (B) 菠菜毛状根诱导的愈伤生长在分化培养基上并产生不定芽; (C) 菠菜毛状根经由愈伤组织诱导分化再生出的植株; (D) 菠菜野生型种子萌发的植株。Bars=4 cm

进而, 通过在发根农杆菌中导入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的Ti质粒, 并侵染转化菠菜, 获得了含有GFP基因的毛状根, 并能够在荧光显微镜下观察到显著的绿色荧光。本研究在苋科蔬菜植物中第一次成功诱导出了毛状根, 并建立了其再生体系, 实现了外源目的基因的转化。该工作为菠菜后基因组时代功能基因的挖掘鉴定提供了便捷的平台, 有利于今后菠菜分子育种工作的快速开展。